■徐詩雨 唐子婷 孫雅荻 李 娜 蔣岳岑 余子康 林居純 舒 剛

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130）

鎘（Cd）是環(huán)境中常見的重金屬污染物，作為重要的工業(yè)原料，其使用量和釋放量不斷增加，環(huán)境分布也不斷擴大。水體和土壤中的鎘元素極易被農(nóng)作物吸收富集，通過食物鏈的形式進入人體，在肝臟、腎臟、肺臟和骨骼等組織器官中蓄積[1]，危害人體健康。鎘吸收進入血液循環(huán)后可快速到達肝臟，在肝臟中進行蓄積。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)染鎘后肝臟體積增大，肝葉腫脹明顯，肝葉間有粘連，邊緣變鈍，顏色紫黑，質(zhì)地變硬，表明鎘對小鼠肝臟損傷極為嚴重[2]。近年來，鎘中毒治療多使用螯合劑，而鎘與螯合劑會形成親脂性較大的螯合物，致使鎘在腦組織重新分布，產(chǎn)生嚴重的副作用[3]。而中藥防治鎘中毒具有時間短、效果好和毒副作用小等特點，是防治鎘中毒的理想藥物來源，其開發(fā)潛力巨大，具有較好的應用前景[4]。

阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸（又稱肉桂酸，3-苯基-2-丙烯酸）的衍生物之一，分子式為C10H10O4。阿魏酸的氧化性強，不僅能抑制產(chǎn)生自由基的酶，還可增加消除自由基酶的活性[5]。除此之外，阿魏酸還具有抗癌、抗血栓、抗菌、抗病毒等藥理作用，在臨床上主要用于防治冠心病、腦梗死和肝臟疾病等。近年來的研究表明，阿魏酸能通過不同機制達到保護肝臟的作用。郭玲等[6]的研究中證明，阿魏酸能通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導肝細胞Smad-3表達，促進MMP-2、MMP-9表達，減少肝細胞凋亡，并促進肝細胞增殖，減輕肝纖維化；鐘正靈等[7]的研究中顯示，阿魏酸對急性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與抗氧化作用有關；阿魏酸還可以通過清除肝臟中的自由基和活性氧來保護肝細胞器和酶結(jié)構(gòu)等，Zhang等[8]試驗證明，阿魏酸可以有效清除過氧化氫、過氧化亞硝基、羥自由基、超氧自由基。何洋[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸能通過抑制關鍵CYP450酶，如CYP1A2、CYP2E1、CYP2A6和CYP3A4蛋白的表達，抑制環(huán)氧化物AFBO 的生成，從而減少活性氧（ROS）含量，緩解肝細胞受到的氧化應激損傷。

目前，阿魏酸與緩解小鼠重金屬中毒引發(fā)的肝臟損傷的相關研究較少。阿魏酸可以緩解鐵過載引起的脂質(zhì)過氧化作用[10]，在李海玲等[11]的試驗證明了阿魏酸清除自由基和活性氧的能力，試驗結(jié)果顯示阿魏酸鈉與?；撬峋汕宄F過載小鼠肝臟中的氧自由基使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物減少，達到穩(wěn)定細胞膜的作用，這為本研究選用阿魏酸來頡頏鎘致小鼠的急性肝損傷的可能性提供了參考。本研究以SPF級（無特定病原體）昆明小鼠為研究對象，初步研究不同濃度的阿魏酸對鎘致小鼠急性肝損傷的保護作用，以期為阿魏酸在緩解畜禽鎘中毒解救中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

80只SPF級雄性小鼠（9周齡），體質(zhì)量（20±2）g，由成都達碩實驗動物中心提供[動物許可證號：SYXK（川）2014-189]，試驗地點為四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系實驗室及動物房。

阿魏酸（購自成都瑞芬思生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：RFS-A00211812016）、氯化鎘（CdCl2分析純，購自成都市科隆化學品有限公司，生產(chǎn)批號：201803820）、4%多聚甲醛固定液（購自Beyotime 公司，生產(chǎn)批號：P0099-500 mL）、氯化鈉（NaCl分析純，購自成都市科隆化學品有限公司，生產(chǎn)批號：2020102801）、純化水；門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（生產(chǎn)批號：20200612）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（生產(chǎn)批號：20200503）、丙二醛（MDA）試劑盒（生產(chǎn)批號：20210827）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（生產(chǎn)批號：20201208）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（生產(chǎn)批號：20210830）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（生產(chǎn)批號：20200910），均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設備

FC 型酶標儀（美國Thermo 公司）、高速冷凍離心機（美國Thermo公司）、電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、RM2245 型轉(zhuǎn)輪式切片機（美國Thermo 公司）、BC-3000plus 全自動動物血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、BI-2000 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗分組及給藥

將80只SPF級雄性小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后隨機分為5 個組，每組16 只，分別為空白組、模型組、低劑量阿魏酸組、中劑量阿魏酸組、高劑量阿魏酸組。低、中、高劑量阿魏酸組分別灌胃低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）阿魏酸，空白組和模型組灌胃同等給藥量的生理鹽水，每天1次，處理14 d。小鼠飼喂于四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物房，室溫（22±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗節(jié)律，自由進食、飲水。在第15天時按照0.2 mL/10 g（體重）灌服氯化鎘溶液（167.3 mg/kg），觀察24 h內(nèi)小鼠死亡情況并記錄死亡時間。

1.3.2 樣品采集

試驗第15天，摘小鼠眼球取血，放于1.5 mL離心管中于室溫下靜置1～2 h，然后4 ℃條件下4 000 r/min離心5 min 分離血清。采用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹，取出肝臟。切大約0.5 g肝右葉制備肝勻漿，取大約0.3 g肝臟用預冷生理鹽水按1∶9(m/V）配制成10%組織勻漿液，取大約0.2 g 肝臟用預冷生理鹽水按1∶4（m/V）配制成20%組織勻漿液，以備后續(xù)試驗。

1.4 指標檢測

1.4.1 肝臟指數(shù)測定

去除肝臟結(jié)締組織，使用生理鹽水清洗肝臟數(shù)次，用濾紙拭干后稱重，計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/小鼠體重（g）×100[12]

1.4.2 血液白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）含量和血細胞比容（HCT）測定

采用摘眼球法收集的小鼠血液0.2～0.4 mL，置于1.5 mL 抗凝血管中，上下輕柔轉(zhuǎn)動使其充分抗凝，混勻后采用BC-3000plus 全自動動物血液分析儀檢測抗凝血中的白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）含量和血細胞比容（HCT）4項生理指標。

1.4.3 血清酶活性測定

將分離的血清，按照南京建成生物工程研究所有限公司提供的試劑盒說明書測定小鼠血清ALT 與AST的活性。

1.4.4 肝組織GSH、SOD活性以及MDA、T-AOC 含量測定

將10%的肝臟組織勻漿分別以2 500、3 000、3 500 r/min的轉(zhuǎn)速各離心10 min，收集上清液用于測定組織勻漿中的SOD、GSH活性和MDA含量；將20%的肝臟組織勻漿以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液測定T-AOC，后續(xù)操作嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.5 肝臟組織病理學檢查

摘取小鼠肝臟病變部分，經(jīng)4%多聚甲醛固定，用乙醇脫水，石蠟包埋，脫模并切片，蘇木精-伊紅（H.E.）染色，采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行拍照以及圖像分析，觀察肝臟組織病理學變化（×200）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標準差”表示，多組均數(shù)間比較采取單因素分析，多重比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 表示顯著差異，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對小鼠肝臟指數(shù)的影響（見表1）

表1 阿魏酸對小鼠肝臟指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯增加（P＜0.05），結(jié)合實際觀察，肝臟有明顯腫大和發(fā)炎的病變情況。與模型組相比，經(jīng)阿魏酸處理后，肝臟指數(shù)明顯減小（P＜0.05），表明阿魏酸對鎘致急性肝損傷有一定的保護作用。

2.2 阿魏酸對小鼠血液中生理指標的影響（見表2）

由表2可知，與模型組相比，經(jīng)阿魏酸處理后，血液中WBC、RBC、HGB 含量和HCT 略有升高，高劑量阿魏酸組WBC和RBC含量與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 阿魏酸對小鼠血液中WBC、RBC、HGB及HCT的影響

2.3 阿魏酸對小鼠血清酶活性的影響（見表3）

從表3 結(jié)果可知，與空白組比較，模型組的AST和ALT 活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，經(jīng)阿魏酸處理后，低、中、高劑量阿魏酸組都可阻止小鼠因鎘引起的血清ALT、AST 活性升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表3 阿魏酸對小鼠血清中AST、ALT活性的影響（U/L）

2.4 阿魏酸對小鼠肝組織抗氧化能力的影響（見表4）

表4 阿魏酸對小鼠肝組織中GSH、SOD、MDA、T-AOC水平的影響

與空白組相比，模型組的MDA含量顯著升高（P＜0.05）；T-AOC 含量、GSH 和SOD 活性呈顯著下降（P＜0.05），說明鎘使模型組小鼠肝細胞出現(xiàn)氧化損傷，機體內(nèi)氧化平衡失調(diào)，證明急性肝臟損傷模型建造成功。

與模型組相比，阿魏酸能降低肝臟MDA含量，但只有高劑量阿魏酸組具有顯著差異（P＜0.05）；中高劑量阿魏酸組小鼠肝組織中SOD、GSH 活性和T-AOC含量顯著升高（P＜0.05），低劑量組小鼠SOD活性呈升高趨勢（P＞0.05），T-AOC 含量和GSH 活性具有升高趨勢，但不具統(tǒng)計學差異，也能說明阿魏酸在一定程度上可恢復肝臟抗氧化酶的活性。

2.5 阿魏酸對小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響（見圖1）

空白組（圖1A）小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完好，肝索排布規(guī)整，肝小葉輪廓清晰，細胞核染色較深，圓形居中；模型組（圖1B）小鼠血管擴張，肝血竇擴張嚴重、肝臟充血、肝細胞間有淋巴細胞浸潤，肝細胞凋亡。經(jīng)阿魏酸處理后，低劑量阿魏酸組（圖1C）小鼠肝細胞間淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，肝細胞有嗜酸性樣變，血管內(nèi)皮增生，肝血竇仍擴張；中劑量阿魏酸組（圖1D）小鼠匯管區(qū)可見淋巴細胞浸潤；并伴有肝細胞水腫；高劑量阿魏酸組（圖1E）小鼠有少量肝細胞水腫，但其他病變并不明顯。

圖1 各組小鼠肝臟組織切片（H.E.染色，×200）

3 討論

3.1 阿魏酸對小鼠肝臟指數(shù)的影響

臟器系數(shù)的變化可反映受試動物臟器的毒性情況，也是尋找毒物靶器官的重要線索[13]。模型組肝臟的臟器系數(shù)顯著高于空白組，說明鎘染毒可對肝臟產(chǎn)生影響，推測這種影響可能是鎘引起肝細胞水腫和壞死性病變，進而可眼觀發(fā)現(xiàn)肝臟腫大或發(fā)炎等病變情況，引起肝臟重量上升；阿魏酸處理后，臟器系數(shù)顯著降低，其原因推測為阿魏酸與重金屬鎘頡頏，降低肝臟的中毒反應。肝是機體中重要的解毒器官，任何藥物或毒物進入體內(nèi)后都要在其中進行代謝，肝臟臟器系數(shù)的升高可能是器官損傷的一種代謝補償效應[14]。說明阿魏酸在一定程度上具有減輕由鎘引起的肝臟損傷的作用。

3.2 阿魏酸對小鼠血液生理指標的影響

阿魏酸能夠抑制與某些細菌、病毒生存相關酶的活性。吳大正等[15]發(fā)現(xiàn)，阿魏酸鈉能夠減輕由炎癥介質(zhì)組胺引起的大鼠腦表面跨毛細血管電阻下降，說明其對組胺造成的腦毛細血管通透性增加具有改善作用，而降低腦毛細血管通透性能夠促進炎癥的改善。有研究表明，鎘暴露會抑制機體免疫，降低白細胞計數(shù)[16]。這一結(jié)論在本試驗中得以證實，模型組小鼠血液中白細胞數(shù)量較空白組顯著減少，表示機體患有輕微炎癥，推測這種現(xiàn)象是由于氯化鎘導致小鼠發(fā)生急性感染，抑制了機體的免疫功能；經(jīng)阿魏酸處理后，低、中、高3個劑量組小鼠白細胞數(shù)量均有回升，其中高劑量阿魏酸組小鼠白細胞總數(shù)升高顯著，表明高濃度的阿魏酸能增強免疫抑制小鼠的免疫功能，提高機體的免疫力，鞏固機體的防御系統(tǒng)，在一定程度上證實阿魏酸具有抗菌消炎的藥理作用。紅細胞的功能以運輸氧氣為主，同時也與機體免疫相關，紅細胞具有強大的免疫黏附作用，能夠識別攜帶抗原，清除機體循環(huán)中免疫復合物，并參與免疫功能調(diào)節(jié)。楊大千[17]研究表明，氯化汞溶液可導致小鼠產(chǎn)生再生障礙性貧血。此結(jié)論與本試驗中結(jié)果一致，模型組小鼠紅細胞總數(shù)顯著降低，經(jīng)阿魏酸處理后，小鼠血液中紅細胞數(shù)目均呈顯著上升趨勢，推測同白細胞類似，是由于阿魏酸增強機體防御屏障功能，提高了小鼠的免疫力所致。

3.3 阿魏酸對小鼠血清酶和肝組織抗氧化活性的影響

AST、ALT是肝細胞內(nèi)酶，兩者在氨基酸的合成與分解代謝中起重要作用。當肝組織受到急性損傷，AST、ALT大量釋放進入血液中，導致血液中AST活性和ALT活性增加，因此可作為評價肝細胞壞死的重要指征[18]。在本試驗中，模型組AST、ALT活性較空白組顯著升高，表明模型組肝臟損傷后引起了細胞膜壞死并可能使細胞膜通透性增加，ALT 和AST 溢出肝細胞，由此導致血清ALT、AST 活性升高。經(jīng)阿魏酸處理后，血清ALT、AST 活性明顯降低且各劑量組都具有統(tǒng)計學意義，肝臟損傷明顯減輕，此結(jié)果表明阿魏酸能顯著降低血清中升高的ALT、AST 活性，從而達到保護肝臟細胞膜的作用。

阿魏酸是一種天然活性物質(zhì)，同時也是一種強抗氧化劑，能夠清除機體內(nèi)過量活性氧（ROS）達到抗氧化損傷、抵抗脂質(zhì)過氧化作用，或直接清除自由基或產(chǎn)生自由基的酶。這一觀點在Zdun’ska等[19]的研究中體現(xiàn)，試驗結(jié)果表明阿魏酸的作用機制是能大大增加谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和醌還原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性。阿魏酸的酚羥基是具有這種清除活性的功能基團。黃華永等[20]證實，阿魏酸及類似物清除自由基活性的強弱與其結(jié)構(gòu)中酚羥基的鄰位取代基有較大的相關性。阿魏酸亦能與膜磷脂酰乙醇胺結(jié)合，保護膜脂質(zhì)不被自由基侵襲，從而發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用[21]。夏雪芬等[22]的試驗表明，阿魏酸糖酯對活性氧誘導劑（AAPH）誘導的大鼠氧化損傷起到較好的保護作用，經(jīng)過證實其可以激活Nrf2抗氧化信號通路，刺激Nrf2/Keap1-ARE抗氧化信號通路下游的相關抗氧化酶的表達。

而鎘攝入過量可在機體包括肝臟等多種組織器官中沉積，其毒性作用可能是蓄積在肝中的鎘會使肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，誘導機體產(chǎn)生大量自由基，進一步加重膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而加重鎘對肝組織的損害[23]。SOD是機體代謝活性氧游離基的主要酶[24]，可以清除機體代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，是衡量機體抗氧化能力的重要指標。MDA 是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應過程中產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，MDA 含量升高是肝損傷的一個重要標志。本次研究發(fā)現(xiàn)，鎘可使急性肝損傷小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量顯著增加，同時明顯降低抗氧化物SOD、GSH 活性，使機體總抗氧化能力顯著下降；T-AOC 含量的降低說明模型組小鼠體內(nèi)氧化還原平衡受到破壞，其余3個指標則說明了鎘引起急性肝損傷的機制與脂質(zhì)過氧化有關。與模型組相比，不同劑量的阿魏酸可以不同程度地減輕由鎘引起的抗氧化酶活性的變化，高劑量阿魏酸能顯著升高肝組織中SOD、GSH 活性和T-AOC 含量，降低升高的MDA 含量，其機制可能與阿魏酸能頡頏機體的氧化壓力，改變部分體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的氧化環(huán)境與抗氧化能力相關[25]。阿魏酸可減弱由自由基誘發(fā)的機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，恢復細胞膜系統(tǒng)損傷及其功能[26]?？敌裾鋄27]的研究表明，阿魏酸可有效地抑制由二價鐵離子誘導的兔肝微粒體脂質(zhì)過氧化，在肝臟微粒體脂質(zhì)過氧化的測定體系中，可以抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，這與本試驗顯示結(jié)果一致。雖然低劑量組的SOD 活性與MDA 含量、中劑量組的MDA 含量與模型組差異不顯著，但在一定程度上也反映了阿魏酸具有頡頏鎘導致的肝臟氧化損傷作用。

3.4 阿魏酸對小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟組織結(jié)構(gòu)的破壞是肝臟受損的直觀病理表現(xiàn)。有研究表明，給小鼠給予鎘處理后，小鼠肝臟細胞腫脹，有嚴重的肝臟炎癥和肝細胞凋亡[28]。在李變麗等[29]的試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鎘染毒后，小鼠的肝臟出現(xiàn)肝細胞排列松散、胞漿內(nèi)充滿小空泡、炎性細胞浸潤及肝細胞出血等現(xiàn)象。在本試驗結(jié)果中，模型組可觀察到肝細胞排列松散，肝細胞間有淋巴細胞浸潤，肝血竇擴張嚴重及肝細胞凋亡現(xiàn)象。與前人試驗結(jié)果基本一致，即顯示鎘對小鼠能造成急性肝損傷。經(jīng)阿魏酸處理后，各劑量小鼠并未再次觀察到有肝細胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生，這與郭玲等[6]的研究成果一致。阿魏酸能減輕病變肝臟內(nèi)肝血竇的擴張程度，減少淋巴細胞浸潤，明顯改善肝損傷，肝細胞死亡減少，且高劑量阿魏酸效果更加明顯。阿魏酸作為一種強抗氧化劑，可以清除活性氧，改善機體脂質(zhì)過氧化，通過這種抗氧化作用，阿魏酸可抑制肝臟內(nèi)的細胞凋亡，類似的結(jié)論在康冠楠等[30]的研究中有所報道。因此推測阿魏酸對抗鎘的肝毒性可能是由于其抗氧化作用。提示阿魏酸將有潛力成為高效、安全的頡頏鎘致小鼠肝臟損傷的藥物。

4 結(jié)論

本試驗研究表明，阿魏酸能夠有效改善由鎘導致的小鼠急性肝損傷，提高肝臟的抗氧化能力，保護肝臟細胞膜，減輕由鎘引起的肝臟病變，當阿魏酸劑量為300 mg/kg處理小鼠時，可最大程度降低其體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，保護肝臟不受損傷，機體的抗氧化功能最強。