李 建 黃宇思 賴 慧 王 謙 米曉琴 趙福蘭 陳 立

參苓安神膠囊是根據(jù)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院一名老中醫(yī)多年臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，以參苓白術(shù)散與棗仁安神顆?；A(chǔ)方加減變化而成，由酸棗仁、黨參、茯苓、陳皮、白術(shù)、甘草等藥物組成的復(fù)方制劑[1]，在臨床應(yīng)用多年，療效確切，安全可靠。本方是治脾虛失眠的代表方。生理?xiàng)l件下,臟腑調(diào)和,氣血充足,心有所養(yǎng),心血得靜,衛(wèi)陽(yáng)入于陰而寐[2]。“脾胃為后天之本”“氣血生化之源”，脾胃虛弱，納運(yùn)乏力，故飲食不化；水谷不化，清濁不分，癥見(jiàn)腸鳴泄瀉，濕滯中焦，氣機(jī)被阻，而見(jiàn)胸脘痞悶；脾失健運(yùn)，氣血生化不足，則心神失養(yǎng)，出現(xiàn)心悸、失眠和健忘，此癥為典型的子病(脾虛)及母(心悸、失眠)，治宜補(bǔ)益脾胃，使心腦有所濡養(yǎng)，而心悸、失眠之證自解[3]。在前期的研究中已將方中酸棗仁、黨參、白術(shù)、陳皮進(jìn)行了薄層定性鑒別[4]。為進(jìn)一步控制制劑，應(yīng)用HPLC對(duì)制劑中所含的有效成分橙皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

SSI(美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司)液相色譜，浙大N3000色譜工作站；JL-180DTH超聲波清洗器；sartoriusBP211D型電子天平(感量0.1 mg；0.01 mg，載量210 g；80 g)，橙皮苷對(duì)照品(721-201211)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，參苓安神膠囊三批(202007012，202007025，202007034);所用甲醇為色譜純，水為醫(yī)院制劑室自制重蒸餾水，試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純，不再一一列出。參苓安神膠囊及陳皮的陰性對(duì)照樣品由醫(yī)院制劑室自制。

2 方法

2.1 指標(biāo)性成分選擇參苓安神膠囊由酸棗仁、黨參、茯苓、陳皮、白術(shù)等組成，可選指標(biāo)成分較多，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)資料研究[5]，酸棗仁為方中君藥之一，但其主要成分酸棗仁皂苷A、B及斯皮諾素在國(guó)內(nèi)復(fù)方制劑中測(cè)定含量的很少，且本方中酸棗仁的用量不大，測(cè)定其含量難度較大，故選性質(zhì)比較穩(wěn)定含量較高的橙皮苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量控制。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)橙皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描(200～700 nm)，由紫外圖譜可見(jiàn)橙皮苷在283 nm波長(zhǎng)處峰最高，是最大吸收，故實(shí)驗(yàn)選擇283 nm 作為本次實(shí)驗(yàn)橙皮苷含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 橙皮苷對(duì)照品溶液的制備精密稱定橙皮苷對(duì)照品6.28 mg于50 ml容量瓶中，制成0.1256 mg/ml的溶液作為母液，稀釋2倍即得。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 提取溶劑的考察取參苓安神膠囊內(nèi)容物共9份，每份1 g，精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇、乙醇及水80 ml，每種溶劑各3份，加熱回流30 min，取出放冷，濾過(guò)，濾液置100 ml容量瓶中，用少量相應(yīng)溶媒分次洗滌，洗液濾入同一容量瓶中，再加相應(yīng)溶媒至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得供試品。按本實(shí)驗(yàn)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。見(jiàn)表1。

表1 提取溶劑的考察結(jié)果

由表1可見(jiàn)，3種提取溶劑中以甲醇作為溶媒，橙皮苷的含量最高，乙醇次之，水最低，故實(shí)驗(yàn)以甲醇作為提取溶劑。

2.4.2 提取方法的考察實(shí)驗(yàn)用超聲處理和加熱回流進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。取參苓安神膠囊內(nèi)容物共6份，每份1 g，精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇80 ml，加熱回流30 min和超聲提取30 min，取出放冷以后，用濾紙濾過(guò)，濾液置洗凈干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗滌[6]，洗液濾并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。按本實(shí)驗(yàn)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，加熱回流所得橙皮苷的含量明顯高于超聲處理結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)選用加熱回流作為橙皮苷提取方法。見(jiàn)表2。

表2 提取方法的考察

2.4.3 提取時(shí)間的考察取參苓安神膠囊內(nèi)容物共3份，每份1 g，按供試品制備方法分別提取15、30、45 min。按色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，加熱回流30 min所得橙皮苷含量最高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇橙皮苷的提取時(shí)間為30 min。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)供試品溶液制備方法如下：取參苓安神膠囊內(nèi)容物1 g,精密稱定，置平底燒瓶中,精密加甲醇80 ml，加熱回流30 min，取出放冷以后，用濾紙濾過(guò)，濾液置洗凈干燥好的100 ml容量瓶中，用少量甲醇分多次洗滌，洗液濾過(guò)后并入同一容量瓶中，再加甲醇至刻度，搖勻，取定容后的溶液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。見(jiàn)表3。

表3 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.5 缺橙皮陰性溶液的制備按供試品制備方法同法制得。

2.6 色譜條件的選擇流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)曾參考陳皮藥材的含量測(cè)定，選用①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；②甲醇：0.05 mol/l磷酸：水(32∶3∶65)；③甲醇-冰醋酸-水(30∶4∶66)[7]；④乙腈-0.15%的醋酸溶液(17∶83)為流動(dòng)相進(jìn)行橙皮苷的含量測(cè)定比較，流速按1.0 ml/min進(jìn)行，柱溫35 ℃，以AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)柱為分析柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果①甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61為流動(dòng)相，橙皮苷達(dá)到基線分離明顯，峰形對(duì)稱；陰性對(duì)照無(wú)干擾。故流動(dòng)相選擇甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)，流速1.0 ml/min，柱溫35 ℃。

分析柱的選擇 實(shí)驗(yàn)曾用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)、Kromtek C18(250×4.6 mm，5 μm)柱[8]，以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)為流動(dòng)相，2根柱子均能達(dá)到滿意的分離效果，橙皮苷峰與相鄰峰分離度都大于1.5，理論塔板數(shù)也大于2000。故方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)選用AichromBond-AQ C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍精密稱定橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成不同濃度的對(duì)照品溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液(0.0628 mg/ml)，分別精密進(jìn)樣1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、9 μl、11 μl、13 μl、15 μl，按色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，橙皮苷進(jìn)樣量在0.0628～-0.942 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)：Y=1E+06X+16645，R2=0.998(Y為峰面積，X為橙皮苷進(jìn)樣量，單位為μg)；最后以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果

3.1 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液(0.0628 mg/ml)及供試品溶液各10 μl，分別注入同一液相色譜儀，按實(shí)驗(yàn)所得出條件進(jìn)行分析，分別測(cè)定5次，計(jì)算峰面積，對(duì)照品峰面積平均值為836741，RSD為0.65%；供試品峰面積平均值為535110，RSD為0.18%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面該儀器精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)按前文對(duì)照品與供試品制備方法分別制得橙皮苷與對(duì)供試品溶液，放置于室溫下，分別在不同的時(shí)間段進(jìn)行含量測(cè)定，記錄色譜圖及結(jié)果，用以考察對(duì)照品與供試品溶液的穩(wěn)定性，供試品及對(duì)照品溶液在配置后24 h內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 樣品重現(xiàn)性試驗(yàn)稱定參苓安神膠囊1 g，共5份，按樣品制備方法和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，參苓安神膠囊供試品含量平均值為2.38%，RSD=0.36%，表明該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取參苓安神膠囊適量，6份，分別加入對(duì)照品，按供試品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，按加樣回收率計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)得平均回收率為99.4%，RSD=0.27%，表明回收率好。

3.5 樣品測(cè)定按參苓安神膠囊含量測(cè)定方法對(duì)參苓安神膠囊3個(gè)批次的樣品進(jìn)行含量測(cè)定，HPLC圖譜見(jiàn)圖1。3個(gè)批次產(chǎn)品每粒含橙皮苷為1.20～1.30 mg，平均為1.26 mg，考慮到參苓安神膠囊含量結(jié)果與原藥材批次有較大關(guān)系，影響藥材含量的因素也較多，而且裝量差異也對(duì)測(cè)定結(jié)果由影響，根據(jù)大生產(chǎn)實(shí)際要求，以平均含量下浮20%計(jì)算，暫定參苓安神膠囊每粒含橙皮苷含量不少于1 mg，待以后在研究中積累數(shù)據(jù)做進(jìn)一步調(diào)整。見(jiàn)表5。

注：對(duì)照品(A)、供試品(B)陰性對(duì)照(C)。圖1 橙皮苷對(duì)照品與供試品HPLC色譜圖

表5 供試品中橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

方中的君藥為黨參、茯苓和白術(shù)，黨參的主要有效成分多糖、苷類和甾醇類，用水煎煮提取，符合傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，提取效果較好，在前期的研究中已經(jīng)對(duì)黨參進(jìn)行了定性鑒別，故未對(duì)黨參進(jìn)行含量測(cè)定[9]；茯苓的主要成分為茯苓聚糖、茯苓酸、脂肪酸及無(wú)機(jī)物等，根據(jù)文獻(xiàn)資料的查詢，暫未找到可行的方法對(duì)茯苓有效成分進(jìn)行測(cè)定；而方中白術(shù)進(jìn)行了揮發(fā)油的提取，也對(duì)白術(shù)進(jìn)行了定性鑒別，所以未對(duì)白術(shù)的定量鑒別進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

試驗(yàn)中曾考慮將酸棗仁皂苷A、B作為質(zhì)量控制指標(biāo)，但由于文獻(xiàn)資料太少，且酸棗仁用量較少，沒(méi)有取得很好的效果，并且酸棗仁在前期的研究中已經(jīng)做了定性研究，而本方是醫(yī)院院內(nèi)制劑，考慮生產(chǎn)成本及實(shí)際生產(chǎn)需要，對(duì)方中的其他藥材沒(méi)有做進(jìn)一步含量測(cè)定，待以后進(jìn)一步研究中逐步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)中甲醇提取和乙醇提取含量差異不大，也曾嘗試將乙醇作為提取溶劑，但乙醇提取成分較多，干擾峰較多，分離度也不好，也不易于揮干，揮干后也難于再次溶解定容， 2.4用HPLC測(cè)定參苓安神膠囊中橙皮苷的含量，可查文獻(xiàn)資料多，技術(shù)成熟，具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、測(cè)定數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點(diǎn),此方法可行性較高,可作為該制劑的質(zhì)量控制。