段 彥, 黃 丹, 周炎輝, 楊富茗, 周婷婷, 李順祥,3, 李 娟,3

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南奇異生物科技有限公司, 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心, 長(zhǎng)沙 410208)

油茶籽油是山茶科山茶屬植物油茶(CamelliaoleiferaAbel.)成熟種子經(jīng)提取所得。研究表明，油茶籽油中富含不飽和脂肪酸，還含有茶皂苷、茶多酚、維生素E、角鯊烯和類胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)[1]，長(zhǎng)期食用可降血脂、降血壓、延緩動(dòng)脈粥樣硬化、降低心血管疾病的發(fā)生率[2]。油茶籽油除食用外，還可外涂于燙燒傷、濕疹等患處，有效治療皮炎、壓瘡、燒傷、新生兒紅臀、尿布皮炎和小兒尿布疹等[3-4]。

油茶籽油因具有與皮膚良好的親和性，對(duì)脂溶性物質(zhì)良好的促滲性[5]，有效抑制皮脂分泌、改善皮膚代謝狀況等優(yōu)點(diǎn)，常被作為化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品的基質(zhì)輔料，但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)精煉的油茶籽油易發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)，從而引起皮膚瘙癢，甚至誘發(fā)皮膚炎癥[6]。因此，工業(yè)上油茶籽油作為化妝品等外用產(chǎn)品的基質(zhì)時(shí)，需經(jīng)過(guò)脫酸、脫色和脫臭等精煉工藝處理。但有研究[7-8]報(bào)道，油茶籽油經(jīng)不同精煉工藝精制后，雖降低了其不良反應(yīng)，但其抗菌消炎活性顯著降低，甚至消失。為此，本文以不同精煉階段的油茶籽油樣品為研究對(duì)象，運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)監(jiān)測(cè)油茶籽油化學(xué)成分的變化規(guī)律，并結(jié)合體外抑菌實(shí)驗(yàn)，分析不同精煉工藝對(duì)油茶籽油抗菌活性物質(zhì)的影響規(guī)律，以進(jìn)一步科學(xué)指導(dǎo)油茶籽油的精煉工藝，為醫(yī)藥產(chǎn)品、防護(hù)化妝品領(lǐng)域開發(fā)質(zhì)優(yōu)穩(wěn)定的油茶籽油基料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽油樣品〔浸出油茶籽原油(JCCY)，批號(hào)為20201028；脫酸油茶籽油(TUCY)，批號(hào)為20201028-1；脫色油茶籽油(TECY)，批號(hào)為20201028-2；脫臭油茶籽油(TCCY)，批號(hào)為20201028-3〕，由湖南奇異生物科技有限公司提供。阿莫西林膠囊(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號(hào)為90305002)，氟哌酸膠囊(河南天方藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為190410132)，氟康唑膠囊(廣東逸舒制藥股份有限公司，批號(hào)為202000204)，營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20191126)，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)為1073301)，氯化三苯基四氮唑試劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20191203)，分析級(jí)乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20210514)，甲酸(德國(guó)CNW公司，批號(hào)為N030K060)，色譜級(jí)甲醇(德國(guó)MERCK公司，批號(hào)為1746030430)，色譜級(jí)乙腈(德國(guó)MERCK公司, 批號(hào)為1746030430)，超純水(實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)自制)。

1.1.2 菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC44102)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC26003)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC90271)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC10231)，均購(gòu)自南京便診生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SPX-70BⅢ型生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái)；BKQ-B50Ⅱ型壓力蒸汽滅菌器；BSA124S-CW型電子天平；HH-600型水浴鍋；MassHunter質(zhì)譜工作站、Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜、Acquity超高效液相色譜儀、雙源電噴霧離子源，美國(guó)Waters公司；Mini-Q Intergral純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同精煉階段油茶籽油樣品的前處理

分別稱取JCCY、TUCY、TECY和TCCY各100 g，置于500 mL分液漏斗中，加入甲醇萃取5次，每次100 mL，合并萃取液，50 ℃減壓濃縮至無(wú)甲醇滴出，冷卻，稱量質(zhì)量，得4種不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液(JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M)和油茶籽油甲醇萃取余相(JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O)，4 ℃保存。

1.2.2 不同油茶籽油樣品供試品溶液的制備

取JCCY、TUCY、TECY、TCCY、JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O各5 g，置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得500 mg/mL的母液，密封，4 ℃保存。另取JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M各1.0 g，置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得100 mg/mL的母液，密封，4 ℃保存。

1.2.3 陽(yáng)性對(duì)照溶液的配制

取阿莫西林(Amoxicillin，AMC)膠囊、氟哌酸(Norfloxacin，NFX)膠囊、氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LU)膠囊各1粒，用無(wú)菌生理鹽水溶解，并稀釋成5 μg/mL的溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得陽(yáng)性對(duì)照溶液，臨配臨用。

1.2.4 抑菌活性考察

1.2.4.1 菌株的復(fù)蘇、培養(yǎng)及菌混懸液制備

將不同菌株分別接種于相應(yīng)的瓊脂平板上，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)18～24 h，真菌培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)純菌落接種于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)節(jié)菌液濃度至1×105CFU/mL。

1.2.4.2 不同油茶籽油樣品抑菌圈的測(cè)定

采用打孔法測(cè)定油茶籽油供試品的抑菌圈[9]。取24 cm×12 cm無(wú)菌瓊脂平板，接種1.0 mL濃度為1×105CFU/mL的菌混懸液，用涂布棒涂布均勻后，用孔徑為6 mm的打孔器打孔，每孔間隔4 cm，用接種針挑出瓊脂塊，每孔加入相應(yīng)油茶籽油供試品溶液(JCCY、TUCY、TECY、TCCY、JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O，工作質(zhì)量濃度均為100 mg/mL;JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M，工作質(zhì)量濃度均為50 mg/mL)各200 μL作為給藥組，無(wú)水乙醇為空白對(duì)照組，以阿莫西林作為S.aureus的陽(yáng)性對(duì)照藥物，氟哌酸作為E.coil和P.aeruginosa的陽(yáng)性對(duì)照藥物，氟康唑作為C.albicans的陽(yáng)性對(duì)照藥物，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)18～24 h，真菌培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，游標(biāo)卡尺檢測(cè)抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.5 不同精煉階段油茶籽油甲醇萃取液的化學(xué)成分分析

取JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M各5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，15 000 r/min離心10 min后，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)待測(cè)。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC-BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脫程序?yàn)?～2 min70%～50% A，2～8 min 50%～30% A，8～16 min30%～20% A，16～28 min 20%～10% A，28～30 min10% A;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:應(yīng)用電噴霧正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)，掃描方式為MRE掃描，使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix(G1969-8500)對(duì)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行矯正。一級(jí)全掃質(zhì)量掃描范圍(m/z)100～1 200，分辨率 30 000，除溶劑氣體為氮?dú)?，干燥氣流?.8 L/min，毛細(xì)管電壓4.0 kV，F(xiàn)ragment電壓110 V，鞘氣溫度350 ℃。二級(jí)質(zhì)譜使用依賴性掃描，在一級(jí)掃描基礎(chǔ)上選擇前三強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)獲取二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油茶籽油樣品抑菌活性比較

以抑菌圈大小衡量油茶籽油樣品的抑菌活性，不同油茶籽油樣品的抑菌圈直徑見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取余相和乙醇空白對(duì)照無(wú)抑菌作用，說(shuō)明溶劑無(wú)干擾；4個(gè)不同精煉階段的油茶籽油樣品及其甲醇萃取液對(duì)E.coil、S.aureus、P.aeruginosa和C.albicans有一定的抑制作用；不同精煉階段的油茶籽油的抑菌活性依次為JCCY>TUCY>TECY>TCCY，不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液的抑菌活性依次為JCCY-M>TUCY-M>TECY-M>TCCY-M，甲醇萃取液的抑菌趨勢(shì)與各精煉階段油茶籽油的抑菌趨勢(shì)相同,說(shuō)明浸出油茶籽原油經(jīng)脫酸、脫色和脫臭等精煉工藝后，其抑菌活性依次降低，在不同的精煉過(guò)程中均去除了一定量的抑菌活性物質(zhì)。不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液的抑菌活性顯著高于相對(duì)應(yīng)的精制油茶籽油，說(shuō)明以甲醇為溶劑，采用萃取的方法可以有效地將油茶籽油中的抑菌成分富集在甲醇萃取液中。

表1 不同油茶籽油樣品的抑菌圈直徑(n=3) mm

2.2 不同精煉階段油茶籽油甲醇萃取液成分變化規(guī)律

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS成分分析

應(yīng)用正、負(fù)離子模式對(duì)油茶籽油甲醇萃取液供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液在正離子模式下的總離子流圖(正離子模式下檢測(cè)出的化合物數(shù)量大于且包括負(fù)離子模式下的所有化合物)見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液供試品溶液的總離子流圖存在較大差異，說(shuō)明浸出油茶籽原油在經(jīng)過(guò)脫酸、脫色和脫臭工藝后，其化學(xué)成分發(fā)生了顯著的變化。在JCCY-M中共鑒定出47個(gè)化合物，TUCY-M、TECY-M和TCCY-M中化學(xué)成分依次減少，JCCY-M的化學(xué)成分組成多為脂肪酸，如油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、山崳酸和花生酸等，以及脂肪酸酯和脂肪酸酰胺等衍生物，還含有根皮素、葛根素、綠原酸、兒茶素衍生物、α-生育酚和3-對(duì)香豆?；鼘幩岬确宇惢衔?，除此之外，還含有芳樟醇-3-鼠李糖基-(1→6)-葡糖糖苷、2,8-二氫喹啉-β-D-葡糖糖苷、茶堿、葉黃素和胡蘿卜素等成分。

圖1 油茶籽油甲醇萃取液在正離子模式下的總離子流圖

2.2.2 差異性化學(xué)成分的篩選與比較

借助MassLynx 4.1工作站，將UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)在正離子模式下選擇合適的加合離子，把4種不同精煉階段油茶籽油的甲醇萃取液分為4組，進(jìn)行峰對(duì)齊、峰提取、歸一化和多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選出符合要求的化合物。將各化合物的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入SIMCA 16.1軟件，進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，得到4種油茶籽油甲醇萃取液的OPLS-DA圖，見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，JCCY-M與其他3種油茶籽油甲醇萃取液(TUCY-M、TECY-M和TCCY-M)分為2類，同時(shí)TUCY-M、TECY-M和TCCY-M之間也有一定的差距，說(shuō)明油茶籽油精煉前后化學(xué)成分存在明顯差異。4種油茶籽油甲醇萃取液的S-plot圖見(jiàn)圖3。如圖3所示，在S-plot圖中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)成分，S曲線兩端的成分即為差異性成分，越靠近兩端表示差異越明顯，VIP值大于1.0即認(rèn)為具有顯著性差異，以此篩選4種油茶籽油甲醇萃取液的差異性成分，結(jié)合4種油茶籽油甲醇萃取液UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果，共篩選出20個(gè)差異性成分，見(jiàn)表2。由表2可知，油茶籽油精煉后甲醇萃取液中具有顯著差異的化合物包括油酸、亞油酸及其衍生物，兒茶素衍生物、α-生育酚、葛根素和綠原酸等多酚類化合物，葉黃素和胡蘿卜素等色素成分。

注：1.JCCY-M; 2.TUCY-M; 3.TECY-M; 4.TCCY-M

圖3 4種油茶籽油甲醇萃取液的S-plot圖

由表2還可知：在經(jīng)過(guò)脫酸工藝后，20個(gè)變化顯著的成分中13個(gè)成分未檢出，包括葛根素、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯、2,8-二氫喹啉-β-D-葡糖糖苷、二十一烷酸、十八胺、十五酸乙酯、茶堿、2,4,12-十八碳三烯酸異丁酰胺、綠原酸、油酸正丁酯和α-生育酚，7個(gè)成分顯著減少；在脫酸基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)脫色和脫臭工藝，7個(gè)減少的成分均未檢出，分別是十五酰甘氨酸、亞油酸、葉黃素、油酸、9-羥基亞油酸、棕櫚油酰乙醇胺和3,6-環(huán)氧基-5,5′,6,6′-四氫-3′,5,5′,6′-四羥基-b,b-胡蘿卜素。

表2 油茶籽油精煉后甲醇萃取液中具有顯著差異的化合物

2.3 分析與討論

油茶籽油主要成分是不飽和脂肪酸，其他活性成分含量均較低，通過(guò)常規(guī)分析檢測(cè)手段如HPLC、GC-MS，許多成分難以檢出，這對(duì)油茶籽油化學(xué)成分的表征有較大的限制，故本實(shí)驗(yàn)采用萃取的方法對(duì)油茶籽油中低含量成分進(jìn)行富集，同時(shí)采用高分辨率、高靈敏度的UPLC-Q-TOF-MS對(duì)甲醇萃取液進(jìn)行分析鑒定，以求全面系統(tǒng)地分析油茶籽油中的化學(xué)成分。進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)時(shí)，要求供試品溶液在培養(yǎng)基中能夠均勻擴(kuò)散，故實(shí)驗(yàn)選擇乙醇為溶劑，設(shè)置溶劑空白，排除乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，同時(shí)在前期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定，確定抑菌圈實(shí)驗(yàn)中不同油茶籽油樣品的最適濃度。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)打孔法對(duì)不同精煉階段油茶籽油及其甲醇萃取液，以及甲醇萃取余相的抑菌活性進(jìn)行考察，綜合比較不同油茶籽油樣品的抑菌圈直徑，確定其抑菌活性物質(zhì)主要存在于甲醇萃取液，后續(xù)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析4種油茶籽油甲醇萃取液的化學(xué)成分，通過(guò)SIMCA 16.1軟件篩選顯著變化的成分，發(fā)現(xiàn)油茶籽油在經(jīng)過(guò)不同的精煉工藝后，其中的部分化學(xué)成分顯著減少。經(jīng)過(guò)水化脫膠和堿煉脫酸后，油酸、亞油酸及其他游離脂肪酸含量顯著減少，可以有效降低油茶籽油的酸值，提高油茶籽油品質(zhì)和保存時(shí)間，同時(shí)沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯和綠原酸等酚類化合物未檢出，推測(cè)此類成分含有多元酚、不飽和酯鍵，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在水化高溫和堿性條件下易分解或生成酚鹽，其分解產(chǎn)物以及酚鹽為水溶性化合物，易溶于水相中而被除去，可能是導(dǎo)致上述成分在脫膠脫酸后未檢出的主要原因；油脂中的色素主要包括有機(jī)色素、有機(jī)降解物和色原體等3類，本研究中油茶籽油是以正己烷冷浸制得，故其中的色素類成分主要是胡蘿卜素(使油脂呈紅色)和葉黃素(使油脂呈黃色)等脂溶性植物色素，在經(jīng)過(guò)活性炭與硅藻土吸附脫色后二者均未檢出，故油脂呈透明狀；在真空脫臭后油茶籽油中引起臭味的組分如低級(jí)醛、酮、游離脂肪酸、不飽和碳?xì)浠衔锏染怀?，在油茶籽油中未檢出，但α-生育酚等低沸點(diǎn)物質(zhì)也在此過(guò)程中損失。

化學(xué)成分的變化影響油茶籽油樣品的抑菌活性，在油茶籽油精煉后除去的成分中，許多成分具有較好的抑菌作用，如沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素和兒茶素沒(méi)食子酸酯等兒茶素衍生物具有較好的抑菌效果，能有效抑制細(xì)菌和真菌[10-12]，綠原酸作為廣譜抑菌活性物質(zhì)，對(duì)多種病原微生物有抑制作用[13]，葛根素、胡蘿卜素和α-生育酚也被證明具有一定的抑菌活性[14-16]，此外，有研究顯示奎寧酸的衍生物同樣具有較好的抑菌作用[17-18]，故油茶籽油中3-對(duì)香豆?；鼘幩嵋部赡苁菨撛诘囊志镔|(zhì)。隨著油茶籽油精煉程度的加深，一些化學(xué)成分不斷減少或者消失，其抑菌活性也不斷降低，但精煉后的油茶籽油仍具有一定抑菌作用，這可能與3-對(duì)香豆?；鼘幩岬拇嬖谙嚓P(guān)。通過(guò)比較分析油茶籽油精煉前后的化學(xué)成分變化及對(duì)抑菌活性的影響，初步推測(cè)油茶籽油中的抑菌活性物質(zhì)是兒茶素衍生物、綠原酸、葛根素、胡蘿卜素、α-生育酚和3-對(duì)香豆?；鼘幩岬瘸煞?。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定油茶籽油在精煉過(guò)程中化學(xué)成分與抑菌活性的變化，將油茶籽油的抑菌活性與其化學(xué)成分關(guān)聯(lián)起來(lái)，推測(cè)出油茶籽油中的主要抑菌活性物質(zhì)為兒茶素衍生物、綠原酸、葛根素、胡蘿卜素、α-生育酚和3-對(duì)香豆?；鼘幩岬瘸煞?。研究結(jié)果可為油茶籽油精煉工藝的優(yōu)化提供部分參考依據(jù)，能提高油茶籽油的附加值，對(duì)油茶籽油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有一定的推動(dòng)作用。本實(shí)驗(yàn)油茶籽油主要作為外用油脂原料和基質(zhì)，適用于化妝品、外用膏劑等產(chǎn)品，在滿足其使用要求的同時(shí)，欲保留其中的抑菌活性成分，根據(jù)上述推測(cè)抑菌成分的性質(zhì)，可對(duì)精煉工藝進(jìn)行改進(jìn)。一是采用更加溫和的精煉技術(shù)，如采用改性膨潤(rùn)土無(wú)水精煉技術(shù)、膜分離技術(shù)以及分子蒸餾技術(shù)等，這些新型技術(shù)反應(yīng)條件溫和，對(duì)油茶籽油中的活性成分影響較??；二是結(jié)合活性成分的理化性質(zhì)，采用合適的手段如萃取、結(jié)晶和蒸餾等，將油茶籽油中的活性成分優(yōu)先分離保存，精煉完成后再重新添加。