曹秋霞，梁文斌，楊 艷，湯玉喜，唐 潔，黎 蕾，黃 鋒

(1.中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術(shù)學院，長沙 410004； 2.湖南省林業(yè)科學院 省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室，長沙 410004； 3.湖南省林業(yè)科學院，長沙 410004； 4.岳陽縣林業(yè)局柏祥林業(yè)工作站，湖南 岳陽 414100)

梔子(GardeniajasminoidesEllis)為茜草科梔子屬的一種常綠灌木[1]，主要分布于湖南、江西、湖北、福建、貴州等地[2]，是我國頒布的第一批藥食兩用資源。研究發(fā)現(xiàn)，梔子成熟果實油脂含量在12%以上，梔子油中脂肪酸含量比例接近大豆油，其中以亞油酸含量最高，達40%以上，且具有較好的穩(wěn)定性和較高的食用價值[3-4]。此外，梔子油還富含甾醇、角鯊烯等活性物質(zhì)[5]，具有增強免疫力、抗炎、抗衰老等作用[6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，梔子油具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥以及促進學習記憶的作用[7]。張俊逸等[8]研究表明，梔子油對對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷具有保護作用。潘文文等[9]研究表明，梔子油可以促進糖酵解，同時還可能通過改善健美操運動員的心肌和血液的供氧環(huán)節(jié)，改善抗缺氧和耐酸的水平，且無任何不良反應。因此，梔子油具有較高的利用價值。

我國食用油進口依存度高，梔子作為木本食用油料作物具有不與糧爭地、一次栽植多年結(jié)實等優(yōu)點，且研究發(fā)現(xiàn)梔子油中飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量的比值更接近世界衛(wèi)生組織和中國營養(yǎng)學會提出的 1∶1∶1 的黃金比例[10-11]，符合國家糧油戰(zhàn)略方向，可作為食用植物油的有效補充。目前國內(nèi)多地建立了梔子發(fā)展合作社，梔子要作為一個產(chǎn)業(yè)發(fā)展，梔子油的提取方法也是實現(xiàn)梔子產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的“助推器”。目前，梔子油提取方法主要為溶劑提取法、壓榨法以及亞臨界提取法等。溶劑提取法中溶劑具有毒性，且揮發(fā)性較強，對環(huán)境和梔子油的品質(zhì)均會造成一定的影響；壓榨法提取效率較低，浪費原料且油品顏色較深；亞臨界提取法設備復雜，操作起來具有一定難度。水酶法是以水為介質(zhì)通過酶的作用來破壞油料細胞壁，從而促使油脂的釋放，其反應條件溫和、耗能低且無需有機溶劑，所獲得油脂品質(zhì)高、色澤淺且副產(chǎn)物少，接近國家一級壓榨油標準，是一種具有應用前景的提油技術(shù)[12-13]。

本研究以梔子成熟果實為原料，從多種水解酶中遴選出最佳酶，并采用均勻設計法優(yōu)化水酶法提取梔子油的工藝條件，旨在為工業(yè)化應用水酶法提取梔子油提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

梔子果實，采用高溫殺青干燥后貯存1年的梔子果實。

中性蛋白酶(10萬U/g)、纖維素酶(5萬U/g)、α-淀粉酶(10萬U/g)，上海藍季生物公司；半纖維素酶(10萬U/g)、果膠酶(10萬U/g)，上海源豐生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，西隴科學股份有限公司。

GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱，HL-200型高速粉碎機，F(xiàn)A2204電子天平，HH-4恒溫水浴鍋，WHY-2水浴恒溫振蕩器，TDL5M臺式低速離心機，筆式酸度計，TRACE1300氣相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取梔子油

參照季澤峰等[14]的方法并進行改進。將梔子果實粉碎過0.425 mm(40目)篩，稱取20 g梔子粉，加入一定量的緩沖液混合浸泡，置于90℃恒溫水浴鍋攪拌10 min高溫滅酶，將其冷卻至酶的最適反應溫度，調(diào)節(jié)pH，加入一定量的酶，恒溫攪拌一定時間，然后升溫至90℃滅酶，于4 500 r/min離心20 min，分離出清油層和乳化層，將乳化層置于-18℃冷藏24 h，50℃水浴加熱2 h，獲取上層清油并與首次所得清油合并稱量質(zhì)量，4℃下保存?zhèn)溆谩０聪率接嬎銞d子油得率(w)。

w=m1/M1×100%

(1)

式中：m1為梔子清油質(zhì)量，g；M1為梔子粉質(zhì)量，g。

1.2.2 梔子油的脂肪酸組成分析

參考GB 5009.168—2016方法進行樣品甲酯化，采用GC-MS測定梔子油的脂肪酸組成。

GC條件：HP-5彈性石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣，流速2 mL/min；升溫程序為初始溫度70℃，以10℃/min的速率升溫至280℃；進樣口溫度280℃;進樣量1 μL，不分流進樣。

MS條件：EI離子源，電離電壓70 eV，溶劑延遲時間5 min，離子源溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z)30～400。根據(jù)峰面積歸一化法計算脂肪酸含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗均設計3個重復，采用DPS軟件進行回歸分析，利用Origin 2018繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶種類對梔子油得率的影響

2.1.1 單一酶對梔子油得率的影響

考察中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶5種酶對梔子油得率的影響。分別在5種酶的最適pH以及最適溫度(見表1)、液料比4∶1、加酶量3%、酶解時間4 h條件下提取梔子油，同時設計對照組(CK，對照組不加酶，反應溫度50℃，不調(diào)節(jié)pH，其他反應條件均與水酶法相同)，計算梔子油得率，結(jié)果見圖1。

表1 5種酶的最適溫度和pH

注：NP.中性蛋白酶；CE.纖維素酶；HE.半纖維素酶；PE.果膠酶；AMY.α-淀粉酶；CK.對照。下同

由圖1可以看出，與對照組相比，5種酶對梔子油得率均有促進作用，其中中性蛋白酶的效果最好，梔子油得率為7.19%，與對照組(3.34%)比提高了115.27%，果膠酶和纖維素酶次之。可能是由于梔子果實中大部分油滴被纖維素以及果膠等包裹，且與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白復合物，因此果膠酶、纖維素酶以及中性蛋白酶對梔子油得率的促進作用較大[3]。另外，中性蛋白酶不僅能破壞脂蛋白、脂多糖等復合物使其釋放油脂[15]，也能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)減少乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生從而使油脂釋放率更高。因此，選擇中性蛋白酶進行復合酶的篩選。

2.1.2 復合酶對梔子油得率的影響

將2.1.1篩選出的酶與其他酶兩兩復合進行實驗，實驗條件為：加酶量3%，酶配比1∶1，液料比4∶1，酶解時間4 h，酶解pH和酶解溫度分別為兩種酶適宜反應范圍的折中點。復合酶對梔子油得率的影響見圖2。

圖2 復合酶對梔子油得率的影響

從圖2可以看出，中性蛋白酶與果膠酶復合的梔子油得率最高，為6.82%，與對照組相比梔子油得率提高了104.19%，中性蛋白酶與纖維素酶復合次之，梔子油得率為5.75%，與對照組相比提高了72.16%，可能是由于梔子果肉中含有豐富的果膠且大部分脂質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，所以這兩種酶復合對細胞壁的破壞程度較高，促進油脂的釋放。但從梔子油得率來看，中性蛋白酶水解的效果優(yōu)于其與其他酶復合的效果，可能是在兩種酶復合時，由于酶解時間分配以及酶解溫度、酶解pH與單一酶的最適溫度、pH差異較大，且酶與酶之間的相互作用會使酶解液產(chǎn)生更多的乳化層，使油脂不易游離[16]，導致梔子油得率較低。因此，選擇中性蛋白酶進行單因素實驗。

2.2 梔子油提取單因素實驗

2.2.1 加酶量對梔子油得率的影響

在液料比3∶1、酶解溫度50℃、酶解pH 7、酶解時間4 h的條件下，考察中性蛋白酶加酶量對梔子油得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對梔子油得率的影響

從圖3可以看出，隨著加酶量的增加，梔子油得率呈先增加后減少的趨勢，當加酶量為1%時，梔子油得率達到最高，為7.13%。當加酶量較少時，梔子油得率隨著加酶量的增大而提高，可能由于酶與反應底物分子碰撞的概率變大，反應速度提高，可促進梔子油的釋放[17]。但隨著加酶量的持續(xù)增加，底物與酶的反應達到飽和[18]，同時過多酶導致乳化現(xiàn)象嚴重，梔子油得率減少。因此，選擇加酶量為1%。

2.2.2 液料比對梔子油得率的影響

在加酶量1%、酶解時間4 h、酶解溫度50℃、酶解pH 7的條件下，考察液料比對梔子油得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 液料比對梔子油得率的影響

從圖4可以看出，隨著液料比的增大，梔子油得率呈先增加后減少的趨勢，在液料比為4∶1時梔子油得率達到最大，為7.07%。可能是因為當液料比較小時，溶液比較黏稠，酶與底物接觸不夠充分，所以反應不完全，且油脂不易從殘渣中釋放出來[19]。隨著液料比的增加，兩者充分接觸，達到最佳反應效果。液料比過大時，降低了酶的濃度，使酶分子與底物分子之間的碰撞概率下降，導致只有部分底物反應。因此，選擇液料比為4∶1。

2.2.3 酶解pH對梔子油得率的影響

在加酶量1%、酶解時間4 h、酶解溫度50℃、液料比4∶1的條件下，考察酶解pH對梔子油得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解pH對梔子油得率的影響

由圖5可以看出，隨著酶解pH不斷增大，梔子油得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當酶解pH為7時，梔子油得率達到最大，為7.02%。因此，選擇酶解pH為7。

2.2.4 酶解時間對梔子油得率的影響

在加酶量1%、酶解溫度50℃、液料比4∶1、酶解pH 7的條件下，考察酶解時間對梔子油得率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解時間對梔子油得率的影響

由圖6可以看出，隨著酶解時間的不斷延長，梔子油得率先增加后稍下降再增加，可能是由于酶解時間越長，酶與底物反應得更充分。考慮時間成本，選擇酶解時間為7 h。

2.2.5 酶解溫度對梔子油得率的影響

在加酶量1%、液料比4∶1、酶解pH 7、酶解時間7 h的條件下，考察酶解溫度對梔子油得率的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解溫度對梔子油得率的影響

從圖7可以看出，隨著酶解溫度的升高，梔子油得率呈先增加后稍減少的趨勢，在酶解溫度50℃時，梔子油得率達到最高，為6.82%。酶解溫度較低，酶的活性較低，不利于反應的進行；隨著酶解溫度升高，酶的活性不斷增強，催化效果提高，但溫度過高時，會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，引起酶變性或失活，導致梔子油得率降低。因此，選擇酶解溫度為50℃。

2.3 均勻設計法優(yōu)化水酶法提取梔子油工藝

2.3.1 均勻設計實驗與結(jié)果

根據(jù)均勻設計原理結(jié)合單因素實驗結(jié)果，以梔子油得率為指標，利用DPS軟件以加酶量、酶解pH、酶解溫度、酶解時間、液料比為因素設計五因素六水平的均勻設計實驗，均勻設計方案與結(jié)果如表2所示。

表2 均勻設計方案與結(jié)果

2.3.2 均勻設計優(yōu)化

2.3.3 單因子效應分析

根據(jù)二次多項式逐步回歸分析得出回歸方程的通徑系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 各個因素對Y值的通徑系數(shù)

2.3.4 模型驗證實驗

根據(jù)二次回歸方程的數(shù)學模型進行綜合分析得到水酶法提取梔子油最佳工藝條件：加酶量0.655 4%，酶解時間7 h，酶解pH 6.979 2，酶解溫度59.949 1℃，液料比3∶1。在最佳條件下，梔子油得率預測值為7.37%。為了便于實際操作，將最佳工藝條件修正為加酶量0.7%、液料比3∶1、酶解pH 7、酶解溫度60℃、酶解時間7 h。在修正工藝條件下進行3次驗證實驗，梔子油得率為7.27%，與理論預測值接近，表明均勻設計所建模型有效。另外，Durbin-Watson統(tǒng)計量d為1.877 140 44，接近2，進一步說明所建模型有效。

2.4 不同種類酶提取梔子油的脂肪酸組成(見表4)

表4 不同種類酶提取梔子油的脂肪酸組成及含量 %

由表4可知：亞油酸含量最高的為果膠酶提取梔子油，高達56.44%；其次為纖維素酶(56.43%)以及中性蛋白酶(56.23%)的。單一酶提取梔子油中油酸、亞油酸、花生酸總體高于復合酶的，而復合酶提取梔子油的亞麻酸、棕櫚酸含量整體比單一酶的高。單一酶提取梔子油的不飽和脂肪酸含量整體略高于復合酶提取梔子油的。整體來看，不同酶單一或復合提取梔子油的脂肪酸組成及含量無顯著差異。

本文水酶法提取梔子油中亞油酸含量較高，孫諳等[20]采用索氏提取法和冷榨法提取的梔子油中亞油酸含量分別為50.33%和50.58%，而李昊陽等[21]的超臨界萃取法為50.45%，正己烷萃取法為52.51%。梔子油的亞油酸含量接近核桃油的亞油酸含量，因此梔子油可作為一種高級小型木本油料來開發(fā)。

3 結(jié) 論

以高溫殺青干燥貯藏1年的梔子果實為原料，采用均勻設計優(yōu)化水酶法提油工藝。結(jié)果表明：水酶法提取梔子油最佳工藝條件為中性蛋白酶加酶量0.7%、液料比3∶1、酶解pH 7、酶解溫度60℃、酶解時間7 h，在此條件下梔子油得率為7.27%。梔子油中共檢測出6種飽和脂肪酸以及5種不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量高達56%以上，總不飽和脂肪酸含量達到80%左右。

本研究由于供試材料是通過高溫殺青且貯存1年的陳舊梔子果實，受溫度、濕度以及脂肪酸氧化等因素的影響，梔子油得率相對較低。為能更全面地指導梔子產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用，還需進一步從貯藏時間、貯藏條件以及不同貯藏處理對油脂成分的影響等方面進行綜合分析，以期為梔子的開發(fā)利用提供技術(shù)指導和理論支持。