張文娟， 王宏軍， 蔣 紅， 苗 莎， 孫文杰， 鄭心鈺

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

大黃芩魚散由大黃、黃芩、魚腥草3 味藥材組成，具有清熱解毒之功效，收錄于2020 版《中國獸藥典》二部，主治魚蝦類細菌性爛鰓病，同時還可有效的預(yù)防和治療各種鰻魚疾病。 該方中大黃具有清熱解毒、活血祛瘀、促食欲、助消化的作用，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，魚腥草具有清熱解毒、 利尿除濕和清熱止痢的功效。 張蓉等（2019）、李虹穎等（2020）對大黃芩魚散進行了相關(guān)的研究， 而目前對其具有清熱解毒功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及其多重成分、多個靶點、多條途徑的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制鮮見報道。 Hopkins （2008）、 韓彥琪等（2016）提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是可以揭示藥物、靶點及疾病間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的學(xué)科， 可以從分子水平、基因水平進行分析，預(yù)測化學(xué)成分對不同靶點、細胞和器官產(chǎn)生作用的行為，從而對化學(xué)成分的藥理作用及作用機制做出系統(tǒng)地預(yù)測和揭示，有助于快速篩選先導(dǎo)化合物。 鐘仁興等（2020）指出運用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫可以獲悉擬研究中藥材的化學(xué)成分和藥效來構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，可有效地預(yù)測中草藥及其復(fù)方制劑發(fā)揮藥效的成分及其作用機制。 因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對大黃芩魚散中多個化合物構(gòu)建了“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)， 預(yù)測了大黃芩魚散清熱解毒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù) 庫 與 分 析 平 臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）；UNIPROT 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.uniprot.org/）；Swiss Target Prediction 服 務(wù) 器（http://new.swisstargetprediction.ch/）；Cytoscape 3.2.1 軟件，The Cytoscape Consortium 提供。

1.2 目標(biāo)化合物獲取原則 （1）必須是大黃芩魚散中發(fā)揮藥效的主要成分；（2）在相關(guān)中草藥眾多成分中， 為主要有效成分且能夠口服吸收進入血液循環(huán)，設(shè)定口服吸收（OB）值大于等于30 的成分進行研究；（3）兼顧藥材中含量較多的、有活性的代表性化合物。因此，在本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)試驗研究中， 根據(jù)以上三個原則、TCMSP 提供數(shù)據(jù)， 從大黃、黃芩、魚腥草中分別選取一些化合物，共計34個關(guān)鍵化合物為該方法的研究對象（表1）。

表1 大黃芩魚散主要活性成分

1.3 目標(biāo)化合物靶點的預(yù)測 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索，獲取魚腥草、黃芩、大黃相關(guān)靶點信息，利用Swiss Target Prediction 服務(wù)器查找補充相關(guān)靶點信息，并整合二者得到相關(guān)的靶點。 由于檢索到的藥物靶標(biāo)存在命名不規(guī)范等問題，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB 搜索功能，將搜索到的所有靶點校正為其官方正名，實現(xiàn)一致化，并編寫英文縮寫。

1.4 “化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于上述，獲得大黃芩魚散34 個重要化學(xué)成分的靶點結(jié)果，利用Excel 表創(chuàng)建化合物-靶點的相互對應(yīng)關(guān)系， 隨后用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)， 并運用其中的插件Network Analyzer 計算網(wǎng)絡(luò)的特征。 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點（node）表示化合物、靶點，邊（edge）表示化合物-靶點間相互作用。 經(jīng)軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)后，獲得大黃芩魚散“化合物-靶點”之間的相互關(guān)系預(yù)測（圖1）。

2 結(jié)果

2.1 化合物潛在靶點分析結(jié)果 圖1 所示為Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建的34 個化合物與80 個相關(guān)靶點相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，處于大黃芩魚散PPI 網(wǎng)絡(luò)中心的8 個靶點蛋白（表2） 即前列腺素G/H 合酶2 （PS2）、 二肽基肽酶4（DP4）、熱休克蛋白90（HSP90）、雄激素受體（ANDR）、前列腺素G/H 合酶1 （PS1）等度值較高，表示有較多相互作用關(guān)系， 判定這8 個靶點為核心靶點，篩選的靶點與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面有關(guān)，提示大黃芩魚散發(fā)揮清熱解毒藥效的主要化合物與這些蛋白有密切關(guān)系。

2.2 “化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 圖1 中方形表示化合物，圓形表示靶點，線條表示相互作用，顏色越淺表示相互作用越多。 利用Cytoscape 3.2.1 軟件自帶的Network Analyzer 分析獲得該網(wǎng)絡(luò)有114 個節(jié)點 （包括34 個化合物、80 個靶點） 和1330 條邊。 網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，網(wǎng)絡(luò)平均度值為11.667，其中大于平均度值的化合物有25個，分別為黃酮類化合物山奈酚、漢黃芩素、山姜素、 千層紙素A、 蘆薈大黃素、5，2’-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮、金合歡素、黃芩新素、（-）-兒茶素水合物、 蘆丁、 黃芩苷、5，7，8-三羥基黃酮、5，7，4’-三羥基-8- 甲氧基黃酮、5，2’，6’-三羥基-7，8-二甲氧基黃酮、黃芩黃酮I、5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮， 甾醇類化合物β-谷甾醇、α-波菜甾醇，木質(zhì)素類化合物丹參素，有機酸類化合物大黃酸， 其他類化合物左旋乙酸冰片酯、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯、hemo-sol、D-camphene；靶點有24 個，除了表2 中的8 個關(guān)鍵靶點外，還有雌激素受體（ESTR）、鈣調(diào)蛋白（CAL）、蛋白激酶A 催化亞基C-α 的mRNA（PCS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Chk1）、糖原合成酶激酶（GSK3）、細胞分裂蛋白激酶2 （CDPK2）、γ-過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PSK）、細胞周期蛋白（Cyc-A2）、鈉通道蛋白5 型亞基（SCP5）、絲裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）、 蛋白酪氨酸磷酸酶非受體1 型mRNA（PTP）、凝血酶（THR）、碳酸酐酶II（CA2）。 網(wǎng)絡(luò)中有一個化合物與多個靶點相互作用的現(xiàn)象，也有同一個靶點與不同化合物作用的現(xiàn)象， 揭示大黃芩魚散的多成分與多靶點間共同產(chǎn)生作用的機制，與中草藥復(fù)方的作用特點相符合。

表2 大黃芩魚散主要作用的8 個關(guān)鍵靶點

圖1 “化合物-靶點”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

當(dāng)病毒、細菌感染導(dǎo)致咽喉、扁桃體等部位的呼吸道黏膜急性炎癥時，Kawasaki & Kawai（2014）、De Nardo（2015）提出病原體可與免疫細胞上Toll 樣受體（TLRs） 結(jié)合，隨后通過TLRNF-κB 信號通路產(chǎn)生接續(xù)的一系列特定基因表達，最后產(chǎn)生諸如IL-1、IL-6、IL-12 和TNF-α 等炎癥因子，調(diào)節(jié)機體的炎癥反應(yīng)。 同時，IL-1、IL-6 和TNF-α 的增多會活化B 淋巴細胞受體介導(dǎo)的免疫通路而產(chǎn)生抗體， 從而進一步激活MPK、PI3K-AKT 和NF-κB 信號途徑，導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)，誘發(fā)全身性免疫應(yīng)答。 Dinarello（2004）提出前列腺素E2（PGE2）是中樞性正調(diào)節(jié)介質(zhì)之一，很容易彌散透過血腦屏障， 作用于下丘腦溫度敏感神經(jīng)的PGE2 受體， 通過提高細胞內(nèi)cAMP 使調(diào)定點升高， 并且薛瑞等 （2011）、Ricciotti 和FitzGerald（2011）提出PGs 是重要的致炎、致痛和致熱介質(zhì)，PGE2 通過其受體和其他前列腺類物質(zhì)共同以條件依賴方式參與了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的不同階段。本研究的靶點預(yù)測結(jié)果提示，大黃芩魚散中的黃酮類成分山奈酚、漢黃芩素、蘆薈大黃素、金合歡素、黃芩新素、千層紙素A、（-）-兒茶素水合物、蘆丁、黃芩苷，甾醇類成分β-谷甾醇、α-波菜甾醇，木質(zhì)素類成分丹參素，有機酸類成分大黃酸等化合物可通過作用于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、鈣調(diào)蛋白（CAL）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 （AP-1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Chk1）、絲裂原活化蛋 白 激 酶 （MPK14、MPK8） 等 靶 點， 調(diào) 節(jié) 如MAPK、TNF、Toll 樣受體、NF-κB、cAMP、Ca2+等信號通路，產(chǎn)生解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用。 與韓彥琪等（2021）報道的復(fù)方魚腥草合劑清熱解毒藥效物質(zhì)及其作用機制有相似之處。 下一步將利用LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7 細胞炎癥模型，研究大黃芩魚散中主要活性成分作用的信號通路， 以進一步確證大黃芩魚散清熱解毒的作用機制。

綜上所述， 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段構(gòu)建了大黃芩魚散中主要活性成分與可能靶點之間的相互作用， 初步闡釋了其清熱解毒藥效的作用機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)， 為后續(xù)確證大黃芩魚散的作用機制及質(zhì)量標(biāo)志物奠定了理論基礎(chǔ)。