張 艷， 劉雪松， 薛沾枚， 郝敬友， 蘇 景， 史同瑞

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.哈爾濱綠達生動物藥業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150039；3.黑龍江省動物疫病控制中心，黑龍江哈爾濱 150069）

為提高中草藥藥效，充分發(fā)揮其防治疾病的作用， 需要采用不同的方法對中草藥材進行炮制處理。 提取是中草藥炮制加工較為常用的方法，通過將中草藥中的有效活性成分提取出來，不僅能夠提高療效、方便臨床用藥，而且還可以降低大量使用中草藥而引起的毒副作用。中草藥的傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法等，這些方法雖然操作簡單，但存在提取率低，容易破壞中草藥中的有效成分，降低藥物療效等弊端（魏曉楠和郝鐵成，2020）。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，又研發(fā)了超臨界流體萃取法、微波輔助萃取法、超聲波提取法、酶工程提取法、半仿生提取法、超高壓提取法等一些新興的提取方法，并運用在中草藥的提取生產(chǎn)中（薛峰等，2020；魏遠等，2019；顏秀英，2018）。

中草藥酶提取方法是基于生物酶解作用能夠降解中草藥的植物細胞壁， 從而使胞內(nèi)的活性成分游離至介質(zhì)中， 達到中草藥活性成分高效提取的效果。生物酶中草藥提取技術(shù)具有提取率高、無需特殊設(shè)備、成本低廉、安全綠色等獨特優(yōu)勢。 應(yīng)用高產(chǎn)酶微生物發(fā)酵中草藥的酶提技術(shù)， 是現(xiàn)今中草藥酶提領(lǐng)域的研究熱點。 試驗從板藍根樣品中分離篩選出1 株貝萊斯芽孢桿菌， 并測定了分離菌的生物學(xué)特性和產(chǎn)纖維素酶特性， 為其用于板藍根的生物發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 細菌總DNA 提取試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；板藍根，購自購自河北凱達藥業(yè)有限公司；生化反應(yīng)管和藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；16S rRNA 引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 試驗所用其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基 板藍根瓊脂：板藍根粉100 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，牛肉湯1000 mL，pH 7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，葡萄糖10 g，蛋白陳10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g， 蒸餾水1000 mL，pH 7.2；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯和纖維素剛果紅培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 （型號：DH4000II）、超凈工作臺（CJ-2S），購自天津市泰斯特儀器有限公司生；恒溫培養(yǎng)搖床（型號：SPH-2102C），購自上海世平實驗設(shè)備有限公司；立式壓力滅菌器（型號：LDZX-75KBS），購自上海申安醫(yī)療器械廠；PCR 儀， 購自日本TaKaRa 公司；高速多功能中草藥粉碎機（DFY-500），購自溫嶺市林大機械有限公司；PH 計（FE20），購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 菌株分離與篩選 取新鮮板藍根用水將表面沖洗干凈， 再用無菌水浸泡2 ～3 h， 然后用75%乙醇漂洗30 s，無菌水漂洗1 min，2%次氯酸鈉漂洗1 min，75%乙醇漂洗30 s，無菌水漂洗1 min，重復(fù)進行4 次； 取100 μL 最終清洗板藍根的水涂營養(yǎng)瓊脂，30 ℃培養(yǎng)2 d， 觀察有無菌落的生長， 確認是否徹底消毒（高沙爾·卡依爾哈力等，2021）。 板藍根樣品干燥處理后剪碎，研磨，取0.1 g接種5 mL 營養(yǎng)肉湯，30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)16 ～18 h。 取培養(yǎng)液接種營養(yǎng)瓊脂平板，置30 ℃環(huán)境培養(yǎng)18 ～24 h，取不同形態(tài)菌落接種營養(yǎng)瓊脂純化培養(yǎng)。 取純化菌接種板藍根瓊脂和點種纖維素剛果紅瓊脂， 篩選既能在板藍根瓊脂生長又能在剛果紅培養(yǎng)基形成較大透明圈的細菌。 測量透明圈直徑（H）和菌落直徑（C），計算H/C，初步對篩選菌的降解纖維素活力進行評價 （楊捷等，2012）。

1.5 篩選菌株的鑒定 應(yīng)用細菌DNA 提取試劑盒提取細菌總DNA。采用細菌通用引物擴增16S rRNA， 上游引物：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'； 下游引物：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。 PCR 反應(yīng)體系： 總體積25 μL，其中Ex Taq 0.5 μL、10×Buffer 2.5 μL，模板1 μL，dNTPs 為0.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補足25 μL。 擴增條件：94 ℃4 min，94 ℃30 s，55 ℃40 s，72 ℃2 min，35 個循環(huán)，72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取3 μL 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠檢測， 反應(yīng)產(chǎn)物送生工生物測序。 測序結(jié)果進行BLAST 比對，分析同源性，構(gòu)建進化樹。

1.6 篩選菌株生物學(xué)特性試驗

1.6.1 形態(tài)及生化試驗 取在37 ℃環(huán)境培養(yǎng)16、24、48 h 和72 h 的菌株菌液，涂片，革蘭氏染色，鏡檢觀察細菌形態(tài)。取篩選菌分別接種營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂，分別置37 ℃自然和5% CO2厭氧環(huán)境培養(yǎng)，考察菌株對氧的需求。 取培養(yǎng)18 ～20 h的菌液接種生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)觀察細菌生化反應(yīng)特性。

1.6.2 適宜生長溫度測定 取篩選菌于37 ℃環(huán)境130 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h 的培養(yǎng)液， 應(yīng)用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1.0×106cfu/mL，然后接種營養(yǎng)肉湯，分別置10、20、30、35、40、45、50、60、70 ℃環(huán)境130 r/min 振蕩培養(yǎng)。 分別在培養(yǎng)18、24 h 和42 h 取樣，以無菌肉湯作對照，測定各菌液的OD600值。以培養(yǎng)溫度（℃）為橫軸，OD600值為縱軸，繪制菌液含菌量曲線圖。 試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.6.3 適宜生長酸堿度測定 取菌液濃度為1.0×106cfu/mL 的菌液，分別接種pH 2、3、4、5、6、7、8、9 的營養(yǎng)肉湯，37 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng)。 在培養(yǎng)至18、24 h 和42 h 取樣， 以無菌肉湯作對照，測定各菌液OD600值。 以pH 為橫軸，OD600為縱軸，繪制菌液含菌量曲線圖。 試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.6.4 生長曲線繪制 取菌液濃度為1.0×106cfu/mL 的菌液，接種營養(yǎng)肉湯，于37 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)。 在培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、30、36、42、48、56、68、80 h 和92 h 取樣，以無菌肉湯作對照，測定各菌液的OD600值。 以培養(yǎng)時間（h）為橫軸，OD600值為縱軸，繪制細菌生長曲線。 試驗設(shè)3 個重復(fù)。

1.6.5 芽孢形成情況 取培養(yǎng)16、20、24、36、48、64、72 h 的菌液，分別用無菌生理鹽水進行10 倍倍比稀釋。分別取108、109和1010三個稀釋度的菌液0.1 mL，涂營養(yǎng)瓊脂平板，進行細菌計數(shù)。 剩余稀釋菌液置80 ℃水浴作用10 ～15 min， 然后吸取0.1 mL 水浴后菌液，涂營養(yǎng)瓊脂平板，計算芽孢形成率。

芽孢形成率/%=（形成芽孢的菌數(shù)/總菌數(shù)）×100。

1.6.6 藥物敏感性試驗 應(yīng)用K-B 法測定分離菌株的藥物敏感性。 取篩選菌株接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 ～20 h，用無菌營養(yǎng)肉湯調(diào)整菌液至0.5 號麥氏標準管濁度， 然后涂布營養(yǎng)瓊脂平板，待菌液被瓊脂吸收后粘貼藥敏片， 置37 ℃培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑（R）。 試驗重復(fù)3 次。

1.7 菌株產(chǎn)纖維素酶能力測定

1.7.1 繪制葡萄糖標準曲線 參考賴國棟等（2021）的方法進行試驗。配制葡萄糖標準溶液：取葡萄糖在干燥箱中105 ℃烘干2 h 至恒重。 精確稱取葡萄糖100 mg，加入100 mL 容量瓶中，用少量蒸餾水溶解后，定容至刻度，搖勻。 葡萄糖溶液濃度為1 mg/mL，于4 ℃保存冷藏，使用期2 ～3 d。繪制葡萄糖標準曲線：取16 支具塞試管，依次編號0 ～7，并作平行試驗。 分別取1 mg/mL 標準葡萄 糖 溶 液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 和1.4 mL 依次加入各管中，然后再依次加入蒸餾水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL 和0.6 mL，混勻，使各管液量均為2.0 mL。然后各管分別加入DNS 試劑2 mL，混勻，置沸水浴中顯色5 min，立即取出，流水冷卻。 以0 號管作為參考調(diào)零， 測定各溶液OD490值。 以葡萄糖量（mg）為橫軸，以O(shè)D490值為縱軸，繪制葡萄糖標準曲線。

1.7.2 產(chǎn)纖維素酶活力測定 參考王琳等（1998）的方法， 取活化菌液以1%接菌量接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)18 ～24 h，將發(fā)酵液離心，收集上清即為粗酶液，置4 ℃保存?zhèn)溆?。? 支刻度試管，分別加入3 倍稀釋的粗酶液1 mL， 將其中2 支試管沸水浴滅活20 min， 第3支試管于50 ℃水浴1 min。 然后3 支管中分別加入2 mL 已預(yù)熱至50 ℃的0.5% CMC-Na 緩沖液（pH 4.6），混勻，于50 ℃水浴30 min，結(jié)束后各管立即加入3 mL DNS 試劑，混勻，置沸水浴中顯色5 min 立即取出， 流水冷卻， 用蒸餾水定容至10 mL，以對照調(diào)零于490 nm 處測OD 值。 依據(jù)繪制的標準曲線算出還原糖含量， 按照以下公式計算酶活力。 在上述試驗條件下，以1 mL 酶液每分鐘水解纖維素生成1 μg 葡萄糖的量為1 個酶活力單位（U）。

式中：X為纖維素酶酶活力，U/mL；m為吸光度在標準曲線上計算的葡萄糖量，mg；n為酶液稀釋倍數(shù)；V為酶液體積，mL；t 為時間，min；5.56 為

1 mg 葡萄糖的μmoL 數(shù)（1000/180＝5.56）。

1.7.3 產(chǎn)纖維素酶活力曲線繪制 在篩選菌株發(fā)酵培養(yǎng)18 ～72 h 期間，每隔6 h 取樣1 次，按上述試驗方法測定發(fā)酵液中纖維素酶酶活。 設(shè)3 個試驗組和1 個對照組， 每組設(shè)3 個平行。 以時間（t）為橫軸，以纖維素酶活力（X）為縱軸繪制曲線，即得篩選菌的產(chǎn)酶曲線。

1.8 纖維素酶特性測定

1.8.1 熱穩(wěn)定性 取刻度試管8 支， 各管分別加入酶液3 mL，其中7 支為試驗管，1 支為對照管，每組設(shè)3 個平行。 試驗管分別置20、30、40、50、60、70、80 ℃環(huán)境，對照管置室溫，各管分別在各溫度條件下作用1 h，測定相對酶活力。

1.8.2 酸堿穩(wěn)定性 取刻度試管7 支， 各管分別加入粗酶液3 mL， 其中6 支為試驗管，1 支為對照管。 調(diào)節(jié)各管粗酶液pH 至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，對照管不調(diào)節(jié)，30 ℃作用1 h，各管用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液補足9 mL，測定相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶細菌篩選 從分離菌株中篩選出1 株能在剛果紅瓊脂形成較大水解圈的細菌，篩選菌在剛果紅培養(yǎng)基形成的降解圈直徑為9.45 mm，菌落直徑為2.28 mm，菌株H/C 為4.15，說明分離菌株降解纖維能力較強。

2.2 篩選菌株鑒定 篩選菌擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，目的片段大小約600 bp（圖1）。菌株測序結(jié)果顯示， 擴增的序列長度為574 bp，與貝萊斯芽孢桿菌PFY02 和TL4 的同源性達到100%，篩選菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，與相似度高的典型菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹， 并命名為貝萊斯芽孢桿菌NKY1 株（圖2）。

圖1 PCR 擴增結(jié)果

圖2 菌株16S rRNA 基因系統(tǒng)進化樹

2.3 篩選菌種的生物學(xué)特性

2.3.1 形態(tài)及生化試驗特性 顯微鏡觀察篩選菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽性、 粗大桿菌， 菌體兩端鈍圓，多為單在，菌株能夠形成芽孢，芽孢橢圓形，直徑小于菌體（圖3）。 菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水楊苷，水解七葉苷，吲哚、H2S、V-P 試驗陽性，M.R、尿素酶、枸櫞酸鹽試驗陰性。

圖3 篩選菌的菌體形態(tài)（1000×）

2.3.2 適宜生長溫度測定 由圖4 可知， 在環(huán)境溫度10 ～40 ℃，隨著溫度的上升菌液的OD 值逐漸增大，至35 ℃達到峰值，各時間點的OD 值分別為0.150、0.153 和0.161，但與40 ℃比較OD 值差異不顯著（P＞0.05）。當培養(yǎng)溫度大于40 ℃時，菌液OD 值逐漸降低，當溫度達60 ℃時，各時間點菌液的OD 值均小于0.005。 試驗表明，菌株在環(huán)境溫度10 ～60 ℃內(nèi)均能生長，但在30 ～40 ℃時生長良好， 其中35 ～40 ℃是菌株的最適生長溫度。

2.3.3 適宜生長酸堿度測定 由圖5 可知，在pH 5.0 ～8.0 內(nèi)菌株生長良好，最適pH 約為6.0，各時間點菌液OD 值分別為0.837、0.995 和1.135；培養(yǎng)基pH 為3.0 ～4.0 時，各時間點菌液OD 值均低于0.05，不適宜菌株生長。 培養(yǎng)基pH 為9.0 時，各時間點菌液OD 值均為0，基本未見細菌生長。

圖5 篩選菌的適宜生長酸堿度

2.3.4 生長曲線測定 結(jié)果如圖6，菌株在初期培養(yǎng)的4 h 內(nèi)為細菌生長的延遲期，OD 值小于0.3；在培養(yǎng)的5 ～12 h 細菌處于對數(shù)生長期，OD 值達1.201； 在培養(yǎng)的12 ～30 h 為生長穩(wěn)定期，OD值始終保持1.2 左右；30 h 以后為生長衰亡期，OD 值持續(xù)下降。

圖6 篩選菌生長曲線

2.3.5 芽孢形成情況 結(jié)果見圖7， 培養(yǎng)至36 h開始產(chǎn)生芽孢，芽孢形成率達35.4%，隨著培養(yǎng)時間的延長芽孢數(shù)量增多，72 h 時芽孢形成率為82.1%。

圖7 篩選菌的芽孢形成情況

2.3.6 藥物敏感性 由表1 可知， 所有受試藥物中，菌株僅對林可霉素和紅霉素耐藥，對其余藥物均敏感，表明細菌的藥物敏感性好。

表1 篩選菌的藥敏試驗

2.4 篩選菌種產(chǎn)酶性質(zhì)

2.4.1 產(chǎn)纖維素酶能力測定

2.4.1.1 葡萄糖標準曲線繪制 依據(jù)葡萄糖溶液測定結(jié)果得到回歸方程y＝0.8084x－0.0053 （R2＝0.9993），葡萄糖標準曲線見圖8。

圖8 葡萄糖標準曲線

2.4.1.2 產(chǎn)纖維素酶曲線 由圖9 可知， 培養(yǎng)至36 h 時篩選菌的纖維素酶活力達到最大值，為31.97 U/mL，此后纖維素酶活力呈輕微波動。

圖9 產(chǎn)纖維素酶活力曲線

2.4.2 纖維素酶性質(zhì)測定 熱穩(wěn)定性： 結(jié)果見圖10，溫度低于60 ℃時菌株的纖維素酶活力比較穩(wěn)定，均高于90%；溫度大于60 ℃時纖維素酶活力急劇下降， 達到80 ℃時， 纖維素酶活力低于40%。 酸堿穩(wěn)定性：結(jié)果見圖11，pH 7.0 時纖維素酶穩(wěn)定性最好，pH 6.0 ～8.0 時纖維素酶相對穩(wěn)定， 相對酶活力均保持在90%以上，pH 3.0 時纖維素酶穩(wěn)定性急劇下降，相對酶活力僅約20%。

圖10 菌株產(chǎn)纖維素酶熱穩(wěn)定性

圖11 菌株產(chǎn)纖維素酶酸堿穩(wěn)定性

3 討論

試驗從板藍根樣品中分離出一株降解纖維素能力強，可在板藍根培養(yǎng)基生長的細菌，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，其耐藥性差，穩(wěn)定性好，可以作為發(fā)酵板藍根的菌株。 生化結(jié)果顯示，該菌株可以發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，但是對其他糖、醇等均不發(fā)酵。 這與王帥等（2021）從土壤中分離的貝萊斯芽孢桿菌S-3 和繆伏榮等（2021）從茶葉渣中分離的貝萊斯芽孢桿菌Fb 的生化特性相近。 試驗菌株的適宜培養(yǎng)溫度和酸堿度結(jié)果顯示，與陳龍等（2019）分離的高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶貝萊斯芽孢桿菌和王金燕等（2018）分離的貝萊斯芽孢桿菌DY-6 的適宜溫度和酸堿度相一致。 但同時本試驗也與諸多關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的研究結(jié)果存在差異（孫會剛，2021；徐淑琴；2021；張小波，2020）。 原因可能與試驗采用的培養(yǎng)基、搖床參數(shù)和細菌不同有關(guān)。

在試驗所有受試藥物中，分離的貝萊斯芽孢桿菌僅對林可霉素和紅霉素耐藥， 對其余藥物均敏感。 張小波等（2020）從發(fā)病花邊鴨肝臟組織中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌， 分離菌對丁胺卡那、 哌拉西林、 四環(huán)素等三種藥物中度敏感，對多黏菌素、氨芐西林、頭孢他啶、苯唑西林、羧芐西林和青霉素等六種藥物耐藥，原因可能是細菌在動物體內(nèi)經(jīng)多次傳代和動物生長過程中的抗生素添加導(dǎo)致的耐藥基因變化造成的。

試驗采用最常用的DNS 法測定細菌的產(chǎn)纖維素酶活力， 測得該菌株產(chǎn)纖維素酶活力為

31.97 U/mL。孫會剛等（2021）研究產(chǎn)酸性纖維素酶的貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶活力為39.2 U/mL。 陳龍等（2019）研究的高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶活力為 （5.14±0.18）U/mL。 鐘麗娟等（2021）分離的飼用貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活性達65.63 U/mL。 產(chǎn)生纖維素酶活力差異的原因可能與培養(yǎng)條件和碳源、氮源等的不同有關(guān)。

4 結(jié)論

從板藍根中分離到的內(nèi)生細菌為貝萊斯芽孢桿菌，細菌的繁殖條件容易滿足，具有良好產(chǎn)纖維素酶的能力，適宜作為中草藥發(fā)酵菌種。