齊鵬飛 ， 吳艷秋，3， 岳壽松， 張 偉， 李 強(qiáng)邊 斐， 于金慧， 王永軍， 蘇曉軼， 張 燕

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東濟(jì)南 250100；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130124；4.山東省畜牧總站，山東濟(jì)南 250100；5.濟(jì)南市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022；6. 淄博市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，山東淄博 255020）

驢隸屬于馬屬動(dòng)物， 是耐粗飼單胃草食動(dòng)物（劉宇等，2019）， 也是我國(guó)獨(dú)具特色和優(yōu)勢(shì)的畜牧品種（李杰等，2019）。隨著人們對(duì)阿膠、驢肉等驢制品需求量增加，養(yǎng)驢業(yè)逐漸向規(guī)模化、集約化發(fā)展。 規(guī)?；H場(chǎng)多選用玉米青貯（包括全株玉米青貯）、花生秧、豆秸、干玉米秸、麥秸、麥糠、谷秸、花生殼、豆莢皮等粗纖維含量高的飼草料，搭配一定比例的精料飼喂驢，粗纖維的消化吸收率偏低（姜慧新等，2019）。 芽孢桿菌屬細(xì)菌是動(dòng)物飼料添加劑中的重要菌屬，除蠟樣芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌外， 大多數(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)害（Amin等，2019）。 芽孢桿菌屬細(xì)菌能分泌各種酶類、抑菌物質(zhì)和維生素等代謝產(chǎn)物，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收，抑制病原菌生長(zhǎng)，維持腸道菌群平衡，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫（Amin 等，2019；Elshaghabee 等，2017；李春鳳等，2013）。 芽孢桿菌的芽孢能抵抗各種逆境（胃酸、高溫、高鹽、紫外線等）（Olmossoto 等，2020；Elshaghabee 等，2017； 李春鳳等，2013），已成為廣泛應(yīng)用于魚(yú)蝦（Olmos-soto 等，2020）、肉 雞（Xi 等，2019；謝 文 惠，2018；Li 等，2016）、豬（孟祥宇，2018）等漁業(yè)與畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的飼料添加劑。

益生菌具有宿主特異性， 理想益生菌菌株應(yīng)來(lái)源于本源動(dòng)物（Cui 等，2017）。 驢源益生菌研究很少， 到目前為止， 有驢源的1 株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）（劉宇等，2019）、2 株乳酸菌[分別為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）]（王卓等，2021；劉宇等，2017）和1株屎腸球菌 （Enterococcus faecium）（左立康等，2021）的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在分離篩選具有良好益生性能的驢源芽孢桿菌， 為研發(fā)綠色安全的驢用微生態(tài)制劑提供理論和應(yīng)用參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 酵母粉、 蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid 公司；瓊脂粉、牛肉浸粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、剛果紅、羧甲基纖維素鈉等購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、 藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；T5 Super PCR Mix 購(gòu)自青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基配方 LB、 牛肉膏營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、蛋白酶選擇培養(yǎng)基、淀粉酶選擇培養(yǎng)基和纖維素酶選擇培養(yǎng)基配制參照李龍等（2017）的方法。

1.1.3 指示菌株 大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由聊城大學(xué)黑毛驢研究院惠贈(zèng)。

1.2 菌株分離

1.2.1 樣品來(lái)源 在無(wú)棣縣、 禹城市和東阿縣3個(gè)規(guī)模化驢場(chǎng)分別用無(wú)菌袋采集3 頭2 歲左右健康驢新鮮糞便，置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，并于-80 ℃保存，直至菌株篩選。

1.2.2 菌株篩選 分別稱取10 g 驢糞樣品，置于含90 mL 無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適量無(wú)菌玻璃珠），置于搖床180 r/min 充分振蕩30 min，85 ℃水浴處理20 min，依次10 倍梯度稀釋，吸取100 μL 合適梯度樣品涂布LB 平板，置于37 ℃培養(yǎng)24 ～48 h， 根據(jù)菌落形態(tài)挑取芽孢桿菌單菌落，并繼續(xù)劃線培養(yǎng)2 ～3 次，直至菌落純化。

1.3 抑菌活性檢測(cè) 挑取分離純化菌株，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，1%接種于新鮮的肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h， 發(fā)酵液用0.22 μm針孔濾膜過(guò)濾備用。將適量活化金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌分別注入適溫LB 固體培養(yǎng)基，混勻后倒平板。將發(fā)酵液進(jìn)行牛津杯（直徑D0為8 mm） 抑菌試驗(yàn)， 觀察、 記錄抑菌圈直徑D（mm），通過(guò)抑菌帶（D-D0）大小判定菌株抑菌活性。 篩選到2 株芽孢菌對(duì)金黃色葡萄球菌有強(qiáng)抑制作用，分別命名為L(zhǎng)V1 和LV2。

1.4 革蘭氏染色和生化鑒定 革蘭氏染色觀察LV1 和LV2 菌體形態(tài)。 生化試驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》生化鑒定指標(biāo)進(jìn)行。

1.5 16S rDNA 序列分析 參照TIANGEN 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒方法提取LV1 和LV2 總DNA， 采用通用引物7F： 5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT -3′ 和 1540R： 5′ -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′ PCR 擴(kuò)增16S rDNA 片段，產(chǎn)物測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。 所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，并采用Neighbor-Joining 法與相似度較高序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 產(chǎn)酶能力 將LV1 和LV2 菌株點(diǎn)接于蛋白酶選擇培養(yǎng)基、 淀粉酶選擇培養(yǎng)基和纖維素酶選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。 在蛋白酶選擇培養(yǎng)基上直接觀察菌落周圍水解圈情況； 在纖維素酶選擇培養(yǎng)基上先滴加1 g/L 剛果紅溶液染色30 min，再滴加1 mol/L NaCl 溶液，觀察菌落周圍水解圈情況；在淀粉酶選擇培養(yǎng)基上滴加碘液，觀察菌落周圍水解圈情況。

1.7 酸和膽鹽耐受性 用鹽酸將LB 液體培養(yǎng)基pH 調(diào)至2.0、3.0 和4.0， 用牛膽鹽配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%和0.3% 的LB 培養(yǎng)基。 將100 μL培養(yǎng)24 h 的菌液分別接種于9.9 mL 不同pH 液體培養(yǎng)基和不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基中， 置于37 ℃培養(yǎng)4 h。 兩處理分別于0 h 和4 h 時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，記錄為N0和NT，并根據(jù)以下公式計(jì)算存活率。

1.8 耐藥性檢測(cè) 采用K-B 紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定， 根據(jù)抑菌圈大小判定目標(biāo)菌株對(duì)市售常見(jiàn)抗生素藥品敏感性。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn) 抑菌試驗(yàn)結(jié)果獲得兩株對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑制作用的芽孢菌，分別命名為L(zhǎng)V1 和LV2，抑菌圈直徑分別達(dá)26 mm 和28 mm，但對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌無(wú)抑菌活性（圖1）。

圖1 菌株LV1 和LV2 對(duì)3 種指示菌體外抑菌試驗(yàn)

2.2 菌落形態(tài) LV1 和LV2 菌落和芽孢形態(tài)見(jiàn)圖2，兩菌株菌落近圓形或邊緣不規(guī)則，表面粗糙有褶皺，呈灰白色或淡黃色。 LV1 和LV2 革蘭氏染色后可見(jiàn)兩端鈍圓的陽(yáng)性桿狀，芽孢橢圓形，位于細(xì)胞末端或中央，具有芽孢桿菌屬特征。

圖2 LV1 和LV2 菌落及菌體形態(tài)

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 LV1 和LV2 菌株生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》生化鑒定指標(biāo)，初步判斷LV1 和LV2 可能為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表1 菌株LV1 和LV2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 16S rDNA 測(cè)序和進(jìn)化分析 由圖3 可知，LV1 和LV2 菌株16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。 由圖4 遺傳進(jìn)化比對(duì)結(jié)果顯示，LV1 和LV2 16S rDNA 序列完全一致，與參考菌株B.subtilis（登錄號(hào)：NR112629） 和B.subtilis（登錄號(hào)：CP020102）遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，初步判定菌株為枯草芽孢桿菌。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化試驗(yàn)結(jié)果與16S rDNA 分析結(jié)果，可確定LV1 和LV2 為枯草芽孢桿菌。

圖3 16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 基于16S rDNA 基因序列采用鄰接法構(gòu)建菌株LV1 和LV2 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 胞外酶活性 由圖5 可知，在淀粉酶選擇型培養(yǎng)基、 纖維素酶選擇性培養(yǎng)基和蛋白質(zhì)選擇性培養(yǎng)基上，LV1 和LV2 菌株菌落周圍都產(chǎn)生清晰的水解圈，說(shuō)明LV1 和LV2 都能水解淀粉、羧甲基纖維素鈉和蛋白質(zhì)。 其中，LV1 和LV2 降解淀粉透明圈直徑分別為11 mm 和14 mm，菌落直徑分別為6 mm 和4 mm， 透明圈直徑/菌落直徑分別為1.83 和3.5； 降解羧甲基纖維素鈉透明圈直徑分別為20 mm 和19 mm， 菌落直徑分別為7 mm 和8 mm， 透明圈直徑/菌落直徑分別為2.86和2.34；降解蛋白透明圈直徑分別為18 mm 和19 mm，菌落直徑分別為8 mm 和6 mm，透明圈直徑/菌落直徑分別為2.25 和3.17。 LV2 對(duì)淀粉和蛋白的降解能力大于LV1，而LV1 對(duì)纖維素的降解水平略大于LV2。

圖5 菌株LV1 和LV2 在3 種水解酶選擇性培養(yǎng)基的水解特性

2.6 耐酸和耐膽鹽試驗(yàn) 由圖6 可知，LV1 和LV2 都具有很好的耐酸和耐膽鹽活性，隨著pH 升高和膽鹽濃度降低存活率逐漸升高。 LV1 和LV2對(duì)酸性環(huán)境耐受性強(qiáng)，在pH 為2.0 時(shí)，存活率分別為89.9%和112.6%。 LV1 和LV2 對(duì)膽鹽環(huán)境也具有很強(qiáng)的耐受性，在膽鹽含量為0.3% 時(shí)，存活率分別達(dá)到70.2%和94.2%。LV1 和LV2 兩株芽孢桿菌對(duì)酸性環(huán)境和膽鹽環(huán)境都具有很好的耐受性，尤其LV2 菌株對(duì)酸性和膽鹽的耐受性更強(qiáng)。

圖6 菌株LV1 和LV2 對(duì)酸性和膽鹽環(huán)境的耐受性

2.7 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。 由表2 可知，LV1 和LV2 菌株對(duì)本試驗(yàn)所用9 種抗生素卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐西林、頭孢拉定、頭孢氨芐、氟羅沙星、環(huán)丙沙星都敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

益生菌能夠提高動(dòng)物免疫力和生產(chǎn)性能，具有無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，成為一種良好的抗生素替代品。 與雙歧桿菌、乳酸菌、腸球菌、酵母菌等益生菌相比，芽孢桿菌具有很大優(yōu)勢(shì)（Mingmongkolchai 等，2018）。 一方面，芽孢桿菌可形成堅(jiān)硬、耐逆性強(qiáng)的內(nèi)生孢子，能抵御各種極端環(huán)境（低pH、高溫、高濃度膽鹽等），另一方面，內(nèi)生孢子存活期長(zhǎng) （Mingmongkolchai 等，2017；Cutting，2011）。 枯草芽孢桿菌是目前研究較為透徹的一類菌，也是一種理想的多功能益生菌，其孢子能耐受動(dòng)物消化道逆境， 養(yǎng)殖中能提高飼料轉(zhuǎn)化率， 抑制病原菌的生長(zhǎng) （Olmos-soto 等，2020；Mingmongkolchai 等，2018；Li 等，2016）。本研究通過(guò)對(duì)篩選目標(biāo)菌株生物學(xué)特性測(cè)定， 獲得產(chǎn)酶性能良好、對(duì)酸性和膽鹽有較強(qiáng)耐受性、對(duì)金黃色葡萄球菌有強(qiáng)抑制作用的LV1 和LV2 菌株，綜合生化試驗(yàn)結(jié)果與16S rDNA 測(cè)序分析， 確定兩株菌都為枯草芽孢桿菌，為后續(xù)應(yīng)用提供了便利條件。

驢養(yǎng)殖業(yè)一直以來(lái)都屬小眾產(chǎn)業(yè)， 驢源益生菌的研究較少。 劉宇等（2019）報(bào)道的短小芽孢桿菌LV2 隸屬芽孢桿菌屬，能產(chǎn)纖維素酶（透明圈直徑13 mm，菌落直徑6 mm），有較好抑制金黃色葡萄球菌活性（抑菌圈直徑20 mm，牛津杯直徑8 mm）。 與短小芽孢桿菌LV2 菌株相比，本研究篩選的兩株枯草芽孢桿菌LV1 和LV2，具有更好的抑菌性和產(chǎn)酶性能， 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別達(dá)為26 mm 和28 mm （牛津杯直徑8 mm）， 產(chǎn)纖維素酶活性更好 （透明圈直徑分別為20 mm 和19 mm， 菌落直徑分別為7 mm 和8 mm），并能同時(shí)產(chǎn)淀粉酶（透明圈直徑分別為11 mm 和14 mm，菌落直徑分別為6 mm 和4 mm）和蛋白酶（透明圈直徑分別為18 mm 和19 mm，菌落直徑分別為8 mm 和6 mm），此外，LV1 和LV2對(duì)試驗(yàn)用9 種抗生素都敏感， 傳播耐藥基因的潛在風(fēng)險(xiǎn)小?？莶菅挎邨U菌LV1 和LV2 同時(shí)具備了抑菌、產(chǎn)多種底物降解酶、耐酸和膽鹽能力強(qiáng)、安全性較高的特性，具有很大的應(yīng)用潛力。

抗生素曾在動(dòng)物疫病防控、生長(zhǎng)發(fā)育、飼料轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要作用，但抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性（特別是超級(jí)細(xì)菌）、獸藥藥殘等問(wèn)題出現(xiàn)， 對(duì)畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境安全造成嚴(yán)重威脅（Mingmongkolchai 等，2018）。 隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展和生活水平提高， 人們對(duì)抗生素濫用的負(fù)面影響也越來(lái)越重視，歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)家相繼禁止在飼料中添加抗生素，我國(guó)也于2020 年1 月1 日起， 退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種，自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告）。因此， 尋找用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)疾病防控和促生長(zhǎng)的抗生素替代品成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。 本研究篩選的兩株枯草芽孢桿菌不僅具有降解纖維素、 淀粉和蛋白質(zhì)性能， 還具有很強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌的性能，且無(wú)耐藥性，避免菌株在動(dòng)物腸道內(nèi)抗性基因水平轉(zhuǎn)移，是潛在的微生態(tài)制劑候選菌株?？莶菅挎邨U菌為我國(guó)飼料添加劑名錄（2013）（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045 號(hào)） 可添加菌種，相對(duì)安全，但由于菌株的特異性，其動(dòng)物安全性及動(dòng)物體內(nèi)益生作用還需進(jìn)一步研究。