姚 英，何 鑫，何歡柳，潘子赟，徐 琴，王海瑞*，張萬起*

（1.成都大熊貓繁育研究基地/四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081；2.天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，天津 300070）

碘元素主要以甲狀腺激素的形式調(diào)節(jié)機(jī)體的生長和代謝，碘攝入過少或者過多可導(dǎo)致甲狀腺疾病及機(jī)體其他器官和系統(tǒng)的紊亂[1]，故監(jiān)測機(jī)體的碘營養(yǎng)狀態(tài)對預(yù)防甲狀腺疾病及維持機(jī)體健康等有重要意義。

目前大熊貓的碘營養(yǎng)狀況研究尚屬空白。前人的研究發(fā)現(xiàn)大熊貓血液T3和T4水平是其他同體重大小的真哺乳亞綱動物的64%和47%[2]；此外，野生大熊貓分布在中國四川、甘肅和陜西省等典型碘缺乏的山區(qū)，食譜中竹子占比超過99%，且竹子中含有大量的生氰糖苷[3]，其代謝產(chǎn)物氰化物可在大熊貓體內(nèi)形成高濃度的硫氰酸鹽，后者可競爭性抑制機(jī)體甲狀腺和乳腺對碘的吸收，增加碘的排出[3-5]，因此大熊貓的碘營養(yǎng)生理可能較為獨(dú)特。

大熊貓會隨著季節(jié)的變化采食竹子的不同部位。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)竹子不同部位的碘含量差異大，竹葉碘含量高，竹莖和竹筍碘含量極低[6]。此外前人的研究表明竹子不同部位的生氰糖苷含量也存在差異，通常幼嫩的竹筍含量最高，其次是竹葉和竹莖[5,7]。亞成年階段大熊貓生長速度快，對碘的生理需要量可能更大，是碘營養(yǎng)高敏感群體。因此本研究擬考察圈養(yǎng)亞成年大熊貓?jiān)诓墒巢煌褡硬课粫r的碘營養(yǎng)生理特征，探究適宜的監(jiān)測指標(biāo)，為生產(chǎn)中圈養(yǎng)亞成年大熊貓科學(xué)的飼喂方案的制定提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)在成都大熊貓繁育研究基地（以下簡稱基地）進(jìn)行，試驗(yàn)所有操作通過基地動物福利委員會審核。篩選19只健康的亞成年大熊貓（2～4歲，8只雌性，11只雄性），大熊貓分別在2020年11月—2021年2月采食竹葉（竹葉采食期，采購于四川綿陽）、2021年2—3月采食竹莖（竹莖采食期，采購于四川雅安、眉山、都江堰和綿陽）和2021年3—6月采食竹筍（竹筍采食期，采購于四川雅安、眉山、都江堰、汶川、樂山）。在各采食期的第28天開始代謝試驗(yàn)，竹葉采食期進(jìn)行3次代謝試驗(yàn)（L1、L2和L3，間隔28 d）、竹莖采食期進(jìn)行1次代謝試驗(yàn)、竹筍采食期進(jìn)行2次代謝試驗(yàn)（S1和S2，間隔28 d），共計6次代謝試驗(yàn)，每次代謝試驗(yàn)持續(xù)3 d。

1.2 飼養(yǎng)管理

所有試驗(yàn)大熊貓的飼養(yǎng)管理參照基地正常的亞成年大熊貓日常管理規(guī)定，自由采食竹子和飲水。

1.3 樣品采集

各采食期每隔7 d采集1次相應(yīng)竹子食物樣。為模擬大熊貓的采食模式，采集竹莖時去皮，采集竹筍時僅采集中段筍肉。每次代謝試驗(yàn)時，每只個體連續(xù)3 d采集1次性隨機(jī)尿樣。在各采食期結(jié)束時，試驗(yàn)個體在非麻醉狀態(tài)下進(jìn)行前臂靜脈采血，分離血清。

1.4 實(shí)驗(yàn)室分析

1.4.1 竹子、尿液和血清碘含量的測定

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS,iCAPQ,Thermo Fisher Scientific,德國）測定竹子、尿液和血清中碘的含量，使用100μg/L碲作為內(nèi)標(biāo)。

1.4.2 尿液硫氰酸鹽含量的測定

采用離子色譜法（ICS 3000+，Thermo Fisher Scientific，美國）測定尿樣中硫氰酸鹽（UT）的含量。硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自Sigma-Aldrich（No.207799，ACS reagent，≥99%）。

1.4.3 血清和尿液甲狀腺激素含量的測定

采用直接化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行游離三碘甲狀腺原氨酸（fT3）、游離甲狀腺素（fT4）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）和四碘甲狀腺原氨酸（T4）。試劑盒（ADVIA?Centaur）購買自SIEMENS Healthineers,Inc公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 尿液肌酐含量的測定

采用堿性苦味酸法在全自動生化分析儀（BK200，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）上測定尿樣肌酐（Cr）含量，試劑盒（C051-a）購買自長春匯力生物技術(shù)有限公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。Shapiro-Wilk用于檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Box-Cox進(jìn)行轉(zhuǎn)換。尿樣指標(biāo)3個時期的比較采用重復(fù)測定（正態(tài)分布）或Friedman秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布）；2個時期的比較采用配對T檢驗(yàn)。竹子部位碘含量及血樣指標(biāo)3個時期的比較采用單因素ANOVA，如果F檢驗(yàn)顯著，進(jìn)行Tukey多重比較；血樣指標(biāo)竹葉采食期和竹筍采食期的比較采用配對T檢驗(yàn)。采用Pearson或者Spearman對正態(tài)分布數(shù)據(jù)或者非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果以平均值（標(biāo)準(zhǔn)差）或中位數(shù)（范圍）表示。以P＜0.05為顯著水平，對0.05≤P≤0.10的趨勢結(jié)果進(jìn)行討論。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同竹子部位的碘含量

竹葉、竹莖和竹筍的平均碘含量分別為237.6、28.3和16.2μg/kg，竹葉的碘含量顯著高于竹莖和竹筍（P＜0.05)（圖1）。

圖1 竹葉、竹莖和竹筍的碘含量（鮮樣基礎(chǔ)）Figure 1 Iodine content in bamboo leaf,culm and shoot(fresh matter basis)

2.2 血清碘和甲狀腺激素含量

如表1所示：竹葉采食期和竹莖采食期血清碘（SI）含量顯著高于竹筍采食期（P＜0.05)。竹莖采食期和竹筍采食期血清fT3含量高于竹葉采食期（P＜0.05和P=0.06)。對于血清fT4，竹莖采食期含量最高，其次是竹葉采食期，竹筍采食期含量最低（P＜0.05)。竹莖采食期血清T3含量顯著高于竹葉采食期和竹筍采食期（P＜0.05)。而不同采食期間的血清T4含量無顯著差異（P＞0.05)。

表1 不同采食期亞成年大熊貓血清指標(biāo)Table 1 Serum indexes of sub-adult giant pandas during different feeding stages

2.3 尿碘、硫氰酸鹽、fT3和fT4

測定各代謝試驗(yàn)中間一天隨機(jī)尿樣的碘、硫氰酸鹽、fT3和fT4含量，結(jié)果見表2。尿碘（UI）含量在竹葉采食期-竹莖采食期-竹筍采食期間逐漸顯著降低，但竹筍采食期內(nèi)S2代謝試驗(yàn)的UI顯著高于S1代謝試驗(yàn)（P＜0.05)。尿硫氰酸鹽（UT）含量和尿fT3（UfT3）含量在不同采食期間及同一采食期的不同代謝試驗(yàn)間均無顯著差異（P＞0.05)。竹葉采食期的尿fT4（UfT4）含量顯著高于竹莖采食期和竹筍采食期，但竹筍采食期內(nèi)S1代謝試驗(yàn)的UfT4含量顯著高于S2代謝試驗(yàn)（P＜0.05)。

表2 不同采食期亞成年大熊貓尿樣指標(biāo)Table 2 Urinary indexes of sub-adult giant pandas during different feeding stages

測定尿樣的肌酐含量，并計算肌酐校正尿碘和硫氰酸鹽。竹葉采食期尿碘肌酐比值（UI/Cr）顯著高于竹莖采食期和竹筍采食期，且竹葉采食期內(nèi)3次代謝試驗(yàn)（L1-L2-L3）的UI/Cr逐漸增加，L3和L2代謝試驗(yàn)UI/Cr顯著高于L1代謝試驗(yàn)（P＜0.05)。竹筍采食期UT/Cr顯著高于竹葉采食期和竹莖采食期，而竹葉采食期內(nèi)L3代謝試驗(yàn)UT/Cr顯著高于L2和L1代謝試驗(yàn)（P＜0.05)。

2.4 血清碘與血清甲狀腺激素的相關(guān)性

由于竹莖采食期血樣數(shù)量較少，我們分析了全期SI與血清甲狀腺激素的相關(guān)性，結(jié)果見圖2。SI與血清fT4和血清T4均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)。

圖2 血清碘與血清fT3（A）、fT4（B）、T3（C）和T4（D）相關(guān)性Figure 2 Correlations between serum iodine and serum(A),fT4(B),T3(C)and T4(D)

2.5 尿樣指標(biāo)與血樣指標(biāo)的相關(guān)性

UI與UT在竹葉采食期和竹莖采食期呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)，UI與UfT3在竹葉采食期、竹筍采食期和全期均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)，UI與和UfT4在竹葉采食期、竹莖采食期和全期均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)。

由于血清碘通常反映近期內(nèi)機(jī)體的碘營養(yǎng)狀況，我們分析了L3代謝試驗(yàn)、竹莖采食期和S2代謝試驗(yàn)的尿碘和尿甲狀腺激素與血清碘和血清甲狀腺激素之間的相關(guān)性。UI與SI和SfT4均呈顯著正相關(guān)，與SfT3呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05)；UfT3與SfT3和ST3均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)；UfT4與血清指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P＞0.05)。

3 討論與結(jié)論

碘營養(yǎng)與亞成年動物的正常生長發(fā)育有緊密關(guān)系，但目前尚未有關(guān)于亞成年大熊貓碘營養(yǎng)狀態(tài)的研究報道，更無適宜的監(jiān)測指標(biāo)。

本試驗(yàn)鮮樣基礎(chǔ)的竹葉碘含量顯著高于竹莖和竹筍（均值分別為237.6、28.3和16.2μg/kg），與前期研究的規(guī)律一致，但碘含量數(shù)值高于前期（竹葉192.2 μg/kg、竹莖6.1 μg/kg、竹筍7.2 μg/kg）[6]，尤其是竹莖和竹筍，可能原因是本試驗(yàn)采用的ICP-MS的靈敏度高于前期試驗(yàn)采用的砷鈰催化分光光度法。目前關(guān)于亞成年大熊貓的不同部位竹子采食量還未見報道，參考基地圈養(yǎng)成年大熊貓的數(shù)據(jù)：竹葉、竹莖和竹筍采食期的采食量分別為9.5、12.3和25.0 kg/d[8]，估算亞成年大熊貓通過竹子攝入碘量為竹葉采食期最高，竹莖采食期最低。血清碘和甲狀腺激素是反映機(jī)體碘營養(yǎng)狀況和功能的常用指標(biāo)。本試驗(yàn)竹莖采食期的血清碘與竹葉采食期無差異，而竹莖采食期的血清甲狀腺激素含量高，竹葉采食期的尿碘水平高，這可能與機(jī)體采用多種途徑維持血碘含量穩(wěn)定有關(guān)[9]。竹筍采食期的血清碘和甲狀腺激素T4和fT4含量低于其余兩個采食期，可能是竹筍采食期過多的硫氰酸鹽和低水平的碘攝入導(dǎo)致。

表3 全期尿樣指標(biāo)與血清指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlations between urinary indexes and serum indexes during the whole stage

這是首次有關(guān)亞成年大熊貓甲狀腺激素數(shù)據(jù)的報道。本試驗(yàn)亞成年大熊貓血清fT3和fT4、T3和T4均值（或中位數(shù)）分別為2.5～3.3和6.2～9.4 pmoL/L、0.3～0.6和2.8～4.4 nmoL/L，與文獻(xiàn)中圈養(yǎng)成年大熊貓血清T3含量（0.3～1.4 nmoL/L）接近，但低于其T4含量（9.0～42.5 nmoL/L）[10]，這與兒童甲狀腺激素參考值普遍高于成人的規(guī)律不一致[11]，差異的具體原因仍不清楚，需要進(jìn)一步分析。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各采食期大熊貓血清fT4和T4的變化較fT3和T3更為敏感，與血清碘含量呈顯著正相關(guān)（r=0.57，P＜0.001和r=0.34，P=0.03），這與前人在兒童上發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一致[8]，推測與T4向T3的轉(zhuǎn)換有關(guān)。

大熊貓血樣較為珍貴，因此我們考慮是否可以通過更易獲得的尿樣指標(biāo)來反映大熊貓的碘營養(yǎng)狀況。本試驗(yàn)竹葉采食期的尿碘水平與我們前期測定的亞成年大熊貓尿碘值（59.5μg/L）接近[6]。竹葉采食期的尿碘水平遠(yuǎn)高于竹莖采食期和竹筍采食期，尿碘肌酐比值在不同采食期的規(guī)律與尿碘的規(guī)律一致，推測與竹葉的高碘含量有關(guān)。且尿碘水平與血碘含量呈顯著正相關(guān)（r=0.54，P＜0.001），這與Cui T.K.等[9]報道的結(jié)果一致。

尿fT3水平受不同竹類食物的影響不大，與血清fT3含量正相關(guān)（r=0.34，P=0.03）；而竹葉采食期的尿fT4水平高于另外兩個采食期，與尿碘水平正相關(guān)（r=0.61，P＜0.001），與血清fT4含量僅有相關(guān)趨勢（r=0.29，P=0.07），可能與機(jī)體維持血fT3含量穩(wěn)定有關(guān)。

竹子所含生氰糖苷在大熊貓體內(nèi)的代謝產(chǎn)物硫氰酸鹽可能抑制機(jī)體對碘的吸收。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)竹葉采食期和竹莖采食期的UT與UI顯著正相關(guān)，與我們前期的試驗(yàn)結(jié)果[6]一致。但在竹筍采食期和整個試驗(yàn)期，UT與UI無相關(guān)性，這可能與竹筍采食期UT水平過高有關(guān)。

綜上，本試驗(yàn)首次提供了圈養(yǎng)亞成年大熊貓采食不同竹類食物時的血清碘、血清甲狀腺激素、尿碘、尿甲狀腺激素及尿硫氰酸鹽等數(shù)據(jù)，豐富了亞成年大熊貓生理參數(shù)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為大熊貓碘營養(yǎng)監(jiān)測、甲狀腺疾病相關(guān)研究及科學(xué)飼喂提供參考。血清碘和尿碘隨著不同采食期變化的規(guī)律說明其可作為亞成年大熊貓碘營養(yǎng)狀況的監(jiān)測指標(biāo)。血清和尿樣甲狀腺激素隨采食期的變化及相互之間的相關(guān)性說明血清fT4、fT3和尿fT3可作為亞成年大熊貓甲狀腺功能的監(jiān)測指標(biāo)，但尿樣指標(biāo)的指示性次于血清指標(biāo)。