劉 晗，周 虹，李玥璐，狄濱茹，李薪宇，林 慶

(西南醫(yī)科大學：1.臨床醫(yī)學院；2.基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室；3.麻醉學系，四川 瀘州 646000)

肝再生是動物體內最神秘、最迷人的現象之一。肝切除(70%)或肝損傷后[1]，其特點是恢復迅速。研究發(fā)現，肝部分切除術(PHx)后，細胞因子白細胞介素-6(IL-6)在24 h內的表達明顯高于對照組。在過表達IL-6的小鼠中沒有發(fā)現肝細胞增殖增強，但IL-6基因敲除小鼠在PHx后肝再生被延遲。這表明IL-6是肝臟再生所必需的，但并不啟動肝再生[2]。

近年來，有報道稱IL-10、IL-22等細胞因子在肝臟再生的初始階段發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現，肝臟局部產生IL-22可以促進肝細胞的增殖，但肝臟更容易發(fā)生腫瘤。IL-22對肝臟的炎癥無明顯作用。這些發(fā)現可能為臨床實踐中預測肝臟相關手術的預后提供線索[3]。

IL-24是IL-10家族細胞因子的新成員。IL-24在正常人黑素瘤細胞中的表達高于轉移性黑素瘤細胞。黑色素瘤分化相關基因-7/IL-24(mda-7/IL-24)是一種在體外或體內臨床前動物模型中顯示廣譜抗癌活性的多功能細胞因子[4]。在生理條件下，IL-24主要由活化的單核細胞和T2輔助細胞分泌，而IL-24的主要靶向組織根據受體的表達模式，在起源上是非造血組織，包括皮膚、肺和生殖組織[5-6]。IL-24在肝損傷的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的保護作用，可能用于肝損傷的治療。IL-24對肝細胞的保護作用主要依賴于IL-20R1[7]。IL-22受體的α1亞基(IL-22RA1)只允許IL-20和IL-24信號傳導。IL-20RA和IL-22RA1在某些組織中的表達受到限制，但IL-22RA1在皮膚、胰腺、肝臟、腎臟和腸道中高表達[5-6]。此外，IL-24作為IL-22R的配體，可促進糖尿病db/db小鼠的創(chuàng)面愈合[8]。

1 材料與方法

1.1動物 雄性C57BL/6小鼠(8周，15～20 g)購自南京大學模型動物研究中心(中國南京)。動物的使用得到了西南醫(yī)科大學動物關愛倫理委員會(中國四川)的批準。實驗動物共納入105只，隨機分為3組，分別為PHx組、對照組、假手術組，每組35只。對于70% PHx動物用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，然后結扎并切除中、左肝葉，如前所述[9]。假手術時，打開腹腔，輕輕按摩肝臟，不切除。在手術后的不同時間點，每組隨機選取5只小鼠被實施安樂死，肝臟被取出并在10%磷酸鹽緩沖液(PBS)或福爾馬林中固定。2/3 PHx最常用于嚙齒動物和大型動物，因為其是主要的再生刺激，引起殘余肝臟的同步和均勻反應。為了測試IL-24在再生肝中的功能相關性，對小鼠進行了2/3 PHx。

1.2方法

1.2.1蛋白質印跡法 將小鼠組織在Triton裂解緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 7.4，137 mmol/L 氯化鈉溶液，10%甘油，1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 mmol/L 氟化鈉溶液，5 mg/mL抑肽酶，20 mmol/L 亮肽酶和1 mmol/L 原釩酸鈉)中裂解，并在4 ℃，以12 000 r/min離心15 min。使用BCA測定法測量上清液的蛋白質濃度。將蛋白質樣品用4×十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液[200 mmol/L Tris，pH 6.8，8% SDS，400 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，0.4%溴酚藍，40%甘油]在100 ℃下變性5 min，并進行標準SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和如前所述蛋白質印跡分析[10]。

1.2.2定量即時逆轉錄PCR(q-PCR) 進行半定量即時逆轉錄PCR(sq-PCR)和q-PCR。在指定時間點取標本，應用q-PCR檢測IL-24 mRNA水平，采用q-PCR檢測IL-20R2 mRNA。根據制造商的說明，用TRIzol試劑(Invitrogen，Thermo Fischer，USA)分離總RNA。根據制造商的協議，使用M-MLV逆轉錄酶(美國Promega)進行逆轉錄反應。sq-PCR通過在1%或4%(對于XBP1)瓊脂糖凝膠上運行產物來進行。如前所述，qPCR分析使用SYBR預混料Ex Taq(日本Takara)進行[10]。用18S對結果進行統一化，并使用2-ΔΔCq方法進行定量[11]。引物如下：mouse IL-24,forward:5′-TCTGCGTGTAAGTTCCGAGT-3′,and reverse:5′-GAGAACCACCCCTGTCACTT-3′;mouse IL-20R2,forward:5′-GTCTGGACAA GTCCGTTCATG-3′,and reverse:5′-GCTTCATGTTG GTTGACTGTAC-3′;mouse 18S,forward:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′,and reverse:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′。

1.2.3組織學分析 將小鼠的肝組織在室溫下固定在4%福爾馬林中至少24 h，嵌入石蠟中，并切成5 μm切片。將肝臟切片去蠟化并用蘇木精和伊紅(HE)染色以進行形態(tài)學分析。通過增殖細胞核抗原(PCNA;CST 2586S)免疫染色，如前所述[12]。

2 結 果

2.1mIL-24-Fc融合蛋白誘導角質形成細胞增殖 根據IL-22RA1在上皮細胞和肝臟中均有高表達，將mIL-24-Fc或PBS注射到小鼠皮內。HE染色顯示2組小鼠表皮組織厚度不均勻。2組小鼠均有單層或多層角質形成細胞，1層或2層是最薄的。mIL-24-Fc組和PBS對照組表皮最厚部位如圖1所示。PBS對照組在表皮組織最厚的部分有3～4層角質形成細胞，而mIL-24-Fc組在表皮組織最厚的部分有5～6層角質形成細胞，增厚的表皮覆蓋范圍更廣。

圖1 注射PBS和mIL-24-Fc小鼠皮下石蠟切片(HE染色)

2.2PCNA 通過PCNA染色評估肝再生，PHx后12、48 h肝臟再生顯著增強(圖2A)。但在3、12、48 h，假手術組的肝再生情況相比PHx組并不明顯。因此，PHx小鼠肝質量的恢復機制可能與肝細胞增殖有關。

2.33組谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酸(ALT)水平比較 PHx組、假手術組和對照組分別于3、12、48 h測定血清AST和ALT水平。結果發(fā)現，在上述3個時間點，3組的AST和ALT水平均遠高于對照組。ALT和AST在12 h達到峰值,而ALT和AST水平在48 h低于3 h和12 h。然而,假手術組在3、12、48 h的ALT和AST水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2B、C。

A.對照組(上)、假手術組(中)和PHx組(下)分別在3 h(左)、12 h(中)和48 h(右)進行PCNA染色。B、C分別為對照組、假手術組和PHx組的ALT和AST水平(n=5)。與對照組比較，aP<0.05。圖2 肝部分切除術小鼠模型的建立

2.4肝細胞IL-24 mRNA PHx組和假手術組在3 h時IL-24 mRNA水平均略有下降，假手術組和對照組在12 h時的IL-24 mRNA表達水平相同。然而，PHx組在12 h時IL-24 mRNA的表達水平高于對照組和假手術組。PHx組在48 h時IL-24 mRNA水平顯著升高(圖3A)。經PCNA檢測，48 h時肝細胞增殖明顯增強。因此，推測IL-24通過IL-20R2受體的未知信號通路或非受體方式的信號通路刺激肝細胞增殖。

A、B.q-PCR檢測對照組、假手術組和PHx組在3、12、48 h肝臟中IL-24和IL-20R2 mRNA的轉錄情況(n=5)。與3、12 h比較，aP<0.05；與假手術組比較，bP<0.05。圖3 IL-24與小鼠肝切除后肝細胞增殖相關

2.5IL-20R2 mRNA PHx后IL-20R2 mRNA水平持續(xù)升高，在PHx小鼠3、12、48 h誘導IL-20R2基因轉錄。然而，假手術組IL-20R2基因在3、12、48 h的轉錄水平低于PHx組(圖3B)。

2.6血清 IL-24 蛋白 在指定時間內用ELISA檢測IL-24水平(圖4A)。PHx組和假手術組的血清IL-24水平均顯著升高，在12 h達到峰值，然后開始下降。這與IL-24 mRNA的變化不一致。結果表明，血清IL-24水平的不同是剖腹手術引起的應激反應結果。

A.血清IL-24蛋白ELISA分析；B.假手術組和PHx組在0、3、6、12、24 h肝臟p-STAT3和GAPDH的蛋白質印跡法分析(n=5)。與0 h比較，aP<0.05。圖4 部分肝切除后IL-24通路誘導肝臟應激反應

2.7p-STAT3和GAPDH 在細胞表面與受體結合后，IL-24激活多種細胞內信號通路，包括JAK-STAT通路。分別在0、3、6、12、24 h通過蛋白質印跡檢測PHx組肝臟中的p-STAT3和GAPDH。結果表明，p-STAT3在前3小時內保持激活狀態(tài)，p-STAT3升高在PHx后24 h(圖4B)，這與血清IL-24水平一致。IL-24通過JAK-1與細胞表面受體信號結合，導致p-STAT3轉錄因子的激活。信號通路激活(JAK-1/STAT3)是由剖腹手術引起的應激反應。

3 討 論

越來越多的研究集中在IL-24在人類疾病中的生理功能，因此IL-24被描述為IL-20家族細胞因子的成員，其中大部分集中在抗腫瘤特性上。值得注意的是，有研究發(fā)現IL-24是細胞增殖的新的關鍵介質[6，13]。

本研究表明，將mIL-24-Fc融合蛋白注射到小鼠皮膚中誘導角質形成細胞增殖。由于IL-22RA1在肝臟和上皮細胞中均高度表達，IL-24誘導小鼠角質形成細胞增殖，所以假設IL-24可以誘導肝細胞增殖。因此，在本研究中，確定了IL-24在肝臟再生中的作用。

IL-24通過2種異二聚體受體IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2起作用。在與受體結合后，IL-24誘導p-STAT3轉錄因子的快速激活，其參與細胞存活和增殖[6，13]。本研究結果顯示，剖腹術后，PHx組血清IL-24水平持續(xù)升高，12 h達到峰值，然后開始下降。然而，肝細胞的IL-24 mRNA水平在12 h時顯著升高，在48 h達到峰值，然后開始下降。血清和肝臟中IL-24的不同水平差異顯著，因此檢測到p-STAT3，其是IL-24的下游細胞因子。PHx后p-STAT3不斷升高，在12 h達到峰值，然后開始降低。p-STAT3的不同趨勢與血清IL-24水平一致。值得注意的是，假手術組和PHx組血清IL-24和p-STAT3的變化趨勢是相同的。這些發(fā)現表明，血清IL-24和p-STAT3水平的不同是PHx后應激反應的結果。出乎意料的是，IL-24 mRNA的變化趨勢與血清IL-24的變化趨勢存在顯著差異。這表明IL-24通過未知的細胞表面受體信號通路或非受體的方式促進肝臟再生。

本研究發(fā)現，血清中IL-24的上調是PHx后應激反應的結果。作者假設IL-24通過未知的細胞表面受體信號通路或非受體的方式刺激PHx后肝細胞增殖。然而，IL-24在肝臟再生中的作用尚不完全清楚。因此，IL-24在肝臟再生中的作用仍有待進一步研究。