張桂枝，趙曉陽(yáng)，李新正，張曉戰(zhàn)，靳雙星*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046;2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

雞安卡拉病是由Ⅰ群禽腺病毒C種4型(FAdV-4)引起的一種急性、烈性傳染病，感染雞只表現(xiàn)心包積液-肝炎綜合征及其他并發(fā)癥[1]。近幾年該病在中國(guó)廣泛流行，河南[2]、黑龍江[3]、山東[4]等多個(gè)省份均有報(bào)道，主要發(fā)生于 1～3 月齡雞，3～5周齡雞最易感，最早出現(xiàn)于 7 日齡以下的雛雞。817肉雞、羅曼蛋雞、三黃雞、麻雞等多個(gè)品種雞均有發(fā)病報(bào)道[5]，鴕鳥和麻鴨也有感染發(fā)病[6-7]，給中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。課題組對(duì)2019年禽病門診接診的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)河南地區(qū)規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)FAdV-4感染嚴(yán)重。為了解FAdV-4感染對(duì)雞血清生化指標(biāo)的影響，采集患有心包積液-肝炎綜合征為主要癥狀的病死雞肝臟，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒鑒定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的FAdV-4肝病毒液接種于易感日齡的SPF雞復(fù)制病理模型，觀察感染雞的臨床癥狀和病理變化，檢測(cè)其血清生化指標(biāo)，為進(jìn)一步研究該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料及毒株來(lái)源 河南省中牟縣某雞場(chǎng)20～30 日齡肉雞發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神沉郁，雞冠發(fā)白，排黃色硫磺樣稀便，臥地不起，不久死亡，病死率較高。剖檢心包內(nèi)積有大量淡黃色透明的液體；肝臟腫大呈土黃色、質(zhì)地變脆，有片狀出血和點(diǎn)狀壞死；肺臟瘀血明顯，呈暗紅色；腎臟腫大呈土黃色。采集發(fā)病雞肝臟保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋(購(gòu)于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司)，27 日齡青腳麻雞(購(gòu)買SPF種蛋)由河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室孵化、出雛并飼養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司)、GELDOCXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司)、離心機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司)、微量移液器(德國(guó)Eppendorf 公司)、天平、研缽、微孔濾膜、血細(xì)胞分析儀、全自動(dòng)生化分析儀等。

1.1.4 主要試劑 DNA 提取試劑盒、dNTP和Mix均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，F(xiàn)AdV-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料中病毒基因組DNA提取 取發(fā)病雞肝臟，用滅菌剪刀剪碎，置于滅菌研缽內(nèi)，按照5∶1(V/M)加入PBS液，并加入1000 U/mL青霉素、鏈霉素，研磨成液體，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，即為病毒提取液。濾液按照DNA 提取試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書提取DNA，將所得的 DNA 產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒PCR鑒定 根據(jù)GenBank中禽腺病毒Hexon基因序列(No.KU587519)，參考田開麗[4]設(shè)計(jì)的引物，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增 FAdV-4目的片段的引物，引物序列為：F:5'-TCCATCGACCAGATGGACAACGTCA-3'；R：5'-TTACACGGCGTTGCCTGTGGCGA-3'；預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 347 bp。FAdV-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以提取的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 鑒定，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測(cè)定 用滅菌的PBS液將病毒提取液10倍遞次釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度，分別通過(guò)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，每只雞胚接種0.1 mL，每個(gè)稀釋度接種7只雞胚為1組，同時(shí)設(shè)立PBS液對(duì)照組，以石蠟封口，置于37～38 ℃培養(yǎng)，每天照蛋，24 h之內(nèi)死亡的雞胚棄掉，連續(xù)培養(yǎng)觀察7 d，剖檢雞胚，記錄每組死亡雞胚數(shù)目，按照Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.2.4 人工感染動(dòng)物模型建立 50只27日齡青腳雞隨機(jī)分為2組，攻毒組和對(duì)照組各25只。攻毒組肌肉注射接種FAdV-4 陽(yáng)性病料處理濾液0.5 mL/只，對(duì)照組肌肉注射0.5 mL/只PBS液，攻毒后飼養(yǎng)15 d，觀察記錄對(duì)照組和攻毒組雞的精神狀態(tài)、采食和飲水情況、糞便的變化，以及發(fā)病雞的臨床癥狀和剖檢病理變化、死亡雞只數(shù)等。

1.2.5 血液樣品采集和檢測(cè) 取攻毒組發(fā)病雞血清樣品15份，對(duì)照組血清樣品15份，送至鄭州頤和醫(yī)院檢測(cè)中心，檢測(cè)血清中總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IDBIL)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、肌酐(Cre)、尿酸(UA)和葡萄糖(GLU)等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料中FAdV-4的PCR檢測(cè)

病料經(jīng)PCR鑒定，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，在病料中擴(kuò)增到1 347 bp的特異性條帶，表明所收集病料存在FAdV-4感染。

從圖9中可以清楚的觀察到，當(dāng)鑄膜液中添加不同粒徑的ZIF-8后，膜機(jī)械性能呈現(xiàn)不同趨勢(shì)的變化。其中，添加了70 nm的ZIF-8顆粒的MMM表現(xiàn)出最優(yōu)異的機(jī)械性能。其抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量均有改進(jìn)。相比添加其他兩種ZIF-8顆粒的MMM，添加40 nm的ZIF-8顆粒的MMM的彈性模量有一定減小，添加了100 nm的ZIF-8顆粒的MMM雖然斷裂伸長(zhǎng)率顯著提升但是彈性模量有所降低。這些可能是由于其不同粒徑造成的。

圖1 FAdV-4 RCR檢測(cè)

2.2 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測(cè)定結(jié)果

病毒提取液經(jīng)不同稀釋度稀釋接種9日齡SPF雞胚后，每日觀察雞胚死亡情況，按照Reed-Muench法計(jì)算ELD50，結(jié)果如表1所示。

表1 SPF雞胚死亡

距離比例 =(70%-50%)/(70%-20%)=0.4，LgLD50=-4+0.4 ×(-1)=-4.4，則LD50=10-4.4，即將病毒提取液10-4.4稀釋后，給SPF雞胚接種0.1 mL，可以使50%的SPF雞胚死亡。

2.3 人工感染動(dòng)物模型的建立

攻毒后第1～2天攻毒組雞無(wú)明顯臨床表現(xiàn)。第3天攻毒組6只雞出現(xiàn)精神萎靡、頭頸緊縮、閉目嗜睡、站立不穩(wěn)等癥狀。第4天攻毒組發(fā)病雞達(dá)19只，排淡黃綠色稀便，采食量和飲水量均下降，死亡5只。第5天攻毒組發(fā)病雞出現(xiàn)雞冠蒼白，有貧血癥狀，死亡7只。第6天攻毒組雞死亡2只，第7天攻毒組雞死亡1只。第8天后攻毒雞停止死亡，未死亡雞只癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。攻毒組共死亡15只雞，死亡率為60%(15/25)，死亡主要集中在第4～5天，發(fā)病率為76%(19/25)。對(duì)照組雞均無(wú)異常變化。

剖檢發(fā)病和死亡雞只可見肌肉蒼白(圖2a)；心包內(nèi)積有大量黃色透亮液體，心肌變軟(圖2b)；肝臟顯著腫大，呈土黃色或淡褐色，質(zhì)脆易碎，表面有大小不一瘀血斑和出血癍(圖2c、圖2d)；膽囊充盈，膽汁色淡，稀薄如水；脾臟腫大；肺淤血明顯(圖2e)；腎臟腫大，呈土黃色，質(zhì)軟易碎；胸腺萎縮；腺胃乳頭稍腫大，靠近肌胃處輕微出血；糞便呈黃色(圖2f)。

圖2 FAdV-4感染雞剖檢癥狀

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，攻毒組血清中總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；血清中總蛋白和白蛋白含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，葡糖糖含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。攻毒組血清中堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶略高于對(duì)照組，但二者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；血清中肌酐和尿酸含量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

3.1 人工感染動(dòng)物模型的建立

FAdV-4是中國(guó)FAdV-I主要流行血清型[8-9]。本試驗(yàn)從河南地區(qū)發(fā)病雞體內(nèi)分離出FAdVH-4毒株，通過(guò)肌肉注射途徑接種SPF雞成功復(fù)制出FAdV-4感染病理模型，攻毒后第3天雞只開始出現(xiàn)臨床癥狀，第4天發(fā)病數(shù)達(dá)高峰，發(fā)病率達(dá)76%，死亡主要集中在第4～5天，死亡率為60%，第7天開始逐漸好轉(zhuǎn)。說(shuō)明該分離毒株具有高致病性。姜清云[10]研究了FAdV-4分離株GX01和N01對(duì)SPF雞致病性，發(fā)現(xiàn)2組雞均在感染后3 天出現(xiàn)臨床癥狀，5～7 天發(fā)病達(dá)高峰，但兩組雞發(fā)病數(shù)目有顯著差異。本試驗(yàn)FAdV-4感染雞的發(fā)病時(shí)間、死亡高峰、臨床癥狀和剖檢病理變化與多數(shù)學(xué)者[11-13]報(bào)道的結(jié)果相似。不同的FAdV-4分離株感染后，雞只的發(fā)病時(shí)間、發(fā)病率、病變程度、死亡率存在差異的原因可能與病毒接種量、接種途徑、病毒毒力和接種日齡有一定關(guān)系。

3.2 FAdV-4感染對(duì)組織器官的損傷

許多學(xué)者[5,10,14]研究報(bào)道FAdV-4感染后肝組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，大量病例肝臟先后出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、顆粒變性、水泡變性、脂肪變性和壞死，壞死灶內(nèi)可見大量巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增生，病變的肝細(xì)胞內(nèi)可見核內(nèi)包涵體，竇狀隙狹窄甚至閉塞，膽小管內(nèi)有大量膽汁淤積。牛玉娟[13]研究報(bào)道FAd V-4 的主要靶器官為肝臟和心臟，肝臟中病毒拷貝數(shù)在攻毒后第2天達(dá)到約106，第5天達(dá)到約108，攻毒后第3天肝細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，第5天肝臟病變最為嚴(yán)重；病毒還誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，從而發(fā)生嚴(yán)重的肝功能障礙。本試驗(yàn)復(fù)制出的FAdV-4感染病雞肝臟、心包、肺臟和腎臟病變最明顯。肝臟顯著腫大，呈土黃色或淡褐色，質(zhì)脆易碎，表面有大小不一瘀斑和壞死點(diǎn)；心包內(nèi)積有大量黃色透亮液體，心肌變軟；肺淤血明顯；腎臟腫大，呈土黃色，質(zhì)軟易碎。

3.3 FAdV-4感染對(duì)肝功能生化指標(biāo)的影響

血液中的間接膽紅素隨血液運(yùn)送到肝臟，被肝細(xì)胞攝取與胞漿中載體蛋白相結(jié)合后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成葡糖醛酸膽紅素(直接膽紅素)。當(dāng)肝細(xì)胞破壞時(shí)，對(duì)間接膽紅素的攝取、酯化和直接膽紅素的排泄都受到影響，引起血清中間接膽紅素和直接膽紅素均升高[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4感染后雞血清中總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素均顯著升高，說(shuō)明FAdV-4感染導(dǎo)致肝細(xì)胞對(duì)間接膽紅素的處理能力下降，同時(shí)肝臟生成的一部分直接膽紅素通過(guò)損傷的毛細(xì)膽管滲漏到血竇。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，為肝臟內(nèi)活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨酶之一，一般1%肝細(xì)胞受損，就會(huì)導(dǎo)致血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，該酶活性大小可以反映肝臟受損傷的嚴(yán)重程度。谷草轉(zhuǎn)氨酶主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中，當(dāng)相應(yīng)細(xì)胞受損時(shí)，胞漿內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，血清濃度可升高。堿性磷酸酶在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分布較廣泛，在肝、腎、大小腸和胎盤等可以檢測(cè)到，以肝臟最多，當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)經(jīng)淋巴途徑和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)肝內(nèi)膽汁排泄障礙反流入血，引起血清堿性磷酸酶升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4感染后血清中堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶均極顯著升高，血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶略有升高，與前人[13-14]報(bào)道結(jié)果一致。

3.4 FAdV-4感染對(duì)腎功能生化指標(biāo)的影響

雞的腎臟是尿酸代謝的最重要器官，腎小管上皮細(xì)胞有生成和排泄尿酸兩種功能，血清中的尿酸含量是評(píng)價(jià)禽類腎功能的重要指標(biāo)之一，當(dāng)腎小管細(xì)胞發(fā)生變性時(shí)，尿酸排泄受阻，會(huì)導(dǎo)致尿酸水平升高。肌酐為肌酸代謝的最終產(chǎn)物，血清肌酐通過(guò)腎小球過(guò)濾，不被腎小管重新吸收，經(jīng)尿液排出體外；若腎臟受到損傷，腎小球的濾過(guò)率降低，會(huì)引起血清中肌酐水平升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4感染后血清中肌酐和尿酸水平顯著上升，與前人[13]報(bào)道結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)肌肉注射肝臟病毒提取液成功復(fù)制出FAdV-4感染病理模型；FAdV-4感染可引起血清中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素水平顯著升高，總蛋白、白蛋白濃度顯著下降，葡糖糖含量顯著升高，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性顯著升高，肌酐和尿酸水平顯著上升。