潘立本 閆 雪 劉 佳 吳可心 劉 洋 劉少沖

（1. 東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；3. 中國森林博物館，哈爾濱 150040）

早春開花植物一般為生長在落葉闊葉林下的一些多年生植物，其生命周期短，在早春冰雪初融時迅速展葉，經過短暫的營養(yǎng)生長后在早春開花，并在林冠上層植物展開葉片前完成生活史然后進入休眠狀態(tài)，對林下低光潮濕的環(huán)境適應性較強，同時也具備一定的觀賞和藥用價值。在全球氣候變暖的背景下，人們對早春開花植物的地理分布、資源價值、抗寒性、開花調控的生理機制等方面研究增多。其中，植物激素和次生代謝物是調控植物開花的關鍵物質，我們目前對此方面的理解還不夠深入。

內源激素在植物整個生命周期都發(fā)揮著重要的調控作用。Khan等提出，調節(jié)植物生長和發(fā)育始終是多種植物激素共同作用的結果，植物激素對花發(fā)育的調節(jié)不是由任何單一激素決定的。韓忠海等的研究表明，在羊草拔節(jié)期，葉面噴施GA 和KT 對羊草的開花和結實有促進作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，在羅漢果花芽分化過程中，GA和IAA含量上升，而ABA 和ZR 含量的降低，且高比值的ABA/GA和ZR/GA有利于花芽分化。

酚類代謝物屬于植物的次生代謝產物，在植物中起著重要的作用，它們也參與了植物的開花過程。之前的研究在花中以及開花過程中發(fā)現(xiàn)了黃酮醇類物質的積累，進一步證明了關于黃酮醇可能在植物生殖發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用的假說。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)在花粉形成、花粉粒萌發(fā)和花粉管生長的過程中，IAA 和類黃酮的含量均增加，說明雄性配子體的形成在很大程度上取決于內源性IAA 和類黃酮的水平。在早春植物開花植物中酚類代謝物的含量及變化還有待進一步研究。

東北林下早春開花的草本植物主要集中在百合科（Liliaceae）、堇菜科（Violaceae）、毛茛科（Ra?nunculaceae）等。本研究選用的早春開花植物冰凌花（Regel et Radde）、黑水銀蓮花（（Korsh.）Kom.）、平 貝 母（Maxim）、鹿藥（A. Gray）、頂 冰 花（（L.）Ker-Gawl.）以及非早春開花植物耬斗菜（Pall.）、升麻（L.）、烏頭（Debx.）、藜 蘆（L.）和東北百合（Nakai），它們都分布在百合科和毛茛科，是東北地區(qū)代表性的早春植物。目前對這些植物的研究主要集中在形態(tài)學、開花特性、繁殖與栽培、分子生物學和藥用成分等方面。本研究通過對比分析早春開花植物和非早春開花植物在植物內源激素方面的差異，同時對二者之間的酚類代謝產物進行檢測及分析，進一步揭示早春開花植物在低溫下開花的生理特征變化。

1 材料與方法

1.1試驗材料

本試驗選取的5 種早春開花植物為：冰凌花、黑水銀蓮花、平貝母、鹿藥、頂冰花，它們的花期都在4—5 月；5 種非早春開花植物為：升麻、烏頭、耬斗菜、藜蘆、東北百合，它們的花期在7—8 月。采樣時間為2019 年4 月中旬，在東北林業(yè)大學帽兒山 實 驗 林 場 老 山 地 區(qū)（45°16′23.94″N，127°34′35.67″E），首先建立1 個10 m×10 m 的典型樣地，在樣地內以四角及中心位置設置5 個1 m×1 m的樣方，在樣方內隨機采集10種目標植物，采集部位為植物中部成熟葉片，每種植物3 個生物學重復。樣品經蒸餾水清洗去除表面雜質，液氮速凍后保存至冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2內源激素的提取、純化與檢測

參照Mornya等的方法進行內源激素赤霉素（gibberellin，GA）、生 長 素（indole-3-acetic acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素（ze?atin，ZT）的提取。將0.50 g葉片樣品在10 mL 含有1 mmol·L2，6-二叔丁基對羥基甲苯的80%冷甲醇中研磨成勻漿。將勻漿轉移至試管中，并加入20 mg 聚乙烯聚吡咯烷酮，充分混合均勻后在4 ℃下孵育過夜。孵育結束后6 000 r·min離心20 min，收集上清液，將沉淀在2 mL冷甲醇中萃取12 h，離心后再次收集上清液。合并兩次上清液，使用1 mol·LHCl 將其pH 值調節(jié)至2.5～3.0，并用等體積的乙酸乙酯中提取3次。

通 過C18 Sep-Pak 柱（Waters Corp.，Milford，MA）進行激素純化。先后用純甲醇和去離子水淋洗柱子2 次，再用注射器將樣品加入到柱中，最后用1 mL 80%的甲醇水溶液洗脫2次。洗脫后的組分用真空離心濃縮儀LSE-3K（常州金壇良友儀器有限公司）揮干，重新溶解于0.2 mL 80%的甲醇中，待測。

利用高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)和三重四極桿飛行時間（Q-TOF）串聯(lián)質譜儀（Xevo G2-XS QTof，Waters Corp.，USA）進行檢測。檢測參數(shù)為：毛細管電壓3500 V、碎裂電壓135 V、源溫度350 ℃、霧化壓力40 psi。檢測在ESI+模式下進行，質荷比（/）范圍為50～1 200。流動相以0.5 mL·min的流速進行梯度洗脫：（A）0.04%乙酸-水，（B）0.04%乙酸-乙腈；從0 min 時的5%B 到20 min 時的95%B 到22.1 min 時的5%B，然后保持在5%B直到28 min。

1.3酚類代謝物的提取與檢測

根據(jù)劉洋的方法進行樣品制備：將植物葉的干燥粉末0.5 g 放入25 mL 離心管中，加入70%甲醇10 mL，利用超聲輔助提取法常溫提取45 min，然后8 000 r·min離心10 min，取上清液；再次加入10 mL 的70%甲醇，超聲后離心，將兩次上清液合并；放入真空離心濃縮儀揮干后，加入1 mL的70%甲醇復溶，冰箱中-20 ℃保存。

用高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)和四極桿飛行時間（Q-TOF）串聯(lián)質譜儀（Xevo G2-XS QTof，Wa?ters Corp.，USA）進行測定。參數(shù)如下：毛細管電壓3 000 V，源溫度500 ℃，檢測在ESI+模式下進行，質荷比（/）為50～1 200。通過ACQUITY C18 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm；Waters，中國上海）進行樣品的分離，梯度洗脫使用以下溶劑系統(tǒng)進行：（A）0.05%甲酸-水，（B）0.05%甲酸-乙腈；流速0.5 mL·min，從0 min 時的5%B 到20 min 時的95%B 到22.1 min 時的5%B，然后保持在5%B 直到28 min。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用軟件MassLynx 4.1 對UPLC-MS 數(shù)據(jù)進行分析，按照標準曲線計算得到提取液中各內源激素和酚類化合物的含量（μg·mL）。用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、歸一化處理以及方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示?？傮w比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Mann-Whitney檢驗，以<0.05 作為判斷差異顯著性的標準，<0.01 表示有極顯著差異。酚類化合物數(shù)據(jù)使用MetaboAnalyst 5.0網站進行聚類分析，其他試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1內源激素含量比較分析

植物的內源激素與開花的關系是復雜的，通過激素之間的相互作用，可以影響可溶性糖、蛋白質以及其他營養(yǎng)物質，從而控制植物開花。綜合分析兩類植物的內源激素ABA，GA，IAA，ZT 的比例，我們發(fā)現(xiàn)早春開花植物中的IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA）+ZT/ABA值均顯著低于非早春開花植物（見圖1），而GA/ABA 在兩類植物中差異不顯著。由圖2可知，ABA/GA在兩類植物中無顯著差異，但IAA/GA和ZT/GA在早春開花植物中都顯著低于非早春開花植物。早春開花植物與非早春開花植物中IAA 的差異顯著（見圖3），GA/IAA，ABA/IAA，（GA+ABA+ZT）/IAA 的值在早春開花植物中顯著高于未開花植物，由此可見早春開花植物中的IAA 含量較低。同時，早春開花植物中GA/ZT，ABA/ZT 和（IAA+GA+ABA）/ZT 的值均顯著高于非早春開花植物（見圖4）。綜上所述，在早春開花植物中分布較多的植物激素是GA和ABA，且GA/IAA 和ABA/IAA 的值與非早春開花植物相比普遍較大。

圖1 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與ABA的比例1.冰凌花；2.黑水銀蓮花；3.平貝母；4.鹿藥；5.頂冰花；6.耬斗菜；7.升麻；8.烏頭；9.藜蘆；10.東北百合；不同小寫字母表示早春開花植物差異顯著（P<0.05）；不同大寫字母表示非早春開花植物差異顯著（P<0.05）；*表示早春開花植物與非早春開花植物組間存在差異（P<0.05），**表示兩組間差異極顯著（P<0.01），ns表示兩組間無顯著差異；下同F(xiàn)ig.1 The ratio of other hormones to ABA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants1.Adonis amurensis；2.Anemone amurensis；3.Fritillaria ussuriensis；4.Smilacina japonica；5.Gagea lutea；6.Aquilegia viridiflora；7.Cimicifuga foetida；8.Aconitum carmichaeli；9.Veratrum nigrum；10.Lilium distichum；Different small letters indicate the significant difference between early spring flowering plants（P<0.05）；Different capital letters indicate the significant difference between non early spring flowering plants（P<0.05）；* indicates the difference between early spring flowering plants and non-early spring flowering plants（P<0.05），** indicates the extremely signifi?cant difference between group（sP<0.01），ns indicates that there is no significant difference between the two groups；The same as below

圖2 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與GA3的比例Fig.2 The ratio of other hormones to GA3 in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

圖3 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與IAA的比例Fig.3 The ratio of other hormones to IAA in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

2.2目標酚類化合物分布情況

本研究所檢測的31 種酚類化合物，按照其結構式判定芳香環(huán)上的碳被羥基替代情況、酚羥基的多少及分布狀況和取代基的類型將化合物分為C6C1 骨架、C6C3C6 骨架和C6C3 骨架，及其他相關信息均列于表1。將目標代謝物數(shù)據(jù)標準化后，進行聚類分析以獲得兩類植物葉片中酚類化合物分布的熱圖。如圖5所示，在早春開花植物中顯著積累的有-苯丙氨酸，C6C3 骨架化合物：迷迭香酸、對羥基肉桂酸和肉桂酸；C6C1 骨架化合物：龍膽酸和苯甲酸；C6C3C6 骨架化合物：甘草素、大豆苷元、蘆丁、柚皮苷、紫云英苷、異槲皮苷和花旗松素。而C6C3 骨架化合物：咖啡酸、綠原酸、阿魏酸和芥子酸；C6C1 骨架化合物：原兒茶酸、丁香酸和香草酸；C6C3C6 骨架化合物：異甘草素、染料木素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、橙皮素、柚皮素和染料木苷和白楊素在早春開花植物中積累較少，它們大量積累于非早春開花植物中。

圖5 兩類植物葉片中酚類化合物的聚類分析Fig.5 Hierarchical cluster analysis of phenolic compounds in two types of plant leaves

表1 基于LC-MS測定的目標代謝物基本信息Table 1 Basic information of target metabolites based on LC-MS

3 討論

內源激素參與植物的整個生命過程，并通過在植物體內建立復雜而完整的信號網絡，傳輸外源或內源信號來促進植物生長和發(fā)育。激素平衡假說最早由Luckwill提出，植物的花芽分化可以通過CTK/GA 或GA/CTK 的平衡進行調控，同時控制各種營養(yǎng)物質的代謝。本研究對早春開花植物和非早春開花植物中的內源激素的比值進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)早春開花植物中其他激素與IAA 的比值高于非早春開花植物，而IAA 與其他激素的比值顯著較低（見圖3），表明早春開花植物中IAA 的含量低于非早春開花植物。生長素在花原基的萌發(fā)和花的發(fā)育中起作用。先前的研究結果表明，作為主要生長激素的生長素（IAA）可以響應低溫刺激植物生長，IAA 含量的降低促進了小麥（）花的發(fā)育。Huang 等也發(fā)現(xiàn)IAA 下調會降低bra-miR393 的表達，從而進一步調節(jié)植物開花。我們的研究結果進一步證實了IAA 在植物響應低溫和促進開花中的作用。有些學者認為赤霉素可以參與植物的開花調控，誘導植物進入花期并調節(jié)花的發(fā)育，例如甘藍型油菜（）開花過程中赤霉素的內源性水平上調。在本研究中，早春開花植物中IAA/GA值低于非早春開花植物（見圖2），也證明了赤霉素在早春開花植物中的含量較高。同時我們觀察到，早春開花植物中IAA/ABA，ZT/ABA，（IAA+GA+ZT）/ABA的值均顯著低于非早春開花植物（見圖1），說明早春開花植物中ABA含量相對較高。生理研究表明，花蕾分化過程中蘋果（）的ABA 含量逐漸增加，可以看出高濃度的ABA 促進花芽分化；但是ABA 的含量過高會抑制龍眼花蕾的形成。在草本植物中，ABA 在菊花（）花芽分化過程中也逐漸增加。之前還有研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的ABA 在毛竹（）花的發(fā)育過程中起著促進作用。在本文研究結果中，GA/ZT，ABA/ZT 值以及（IAA+GA+ABA）/ZT 在早春開花植物中顯著高于非早春開花植物（見圖4），由此可見，ZT 在早春開花植物中的含量有所降低。這一結果在先前的研究中也有報道，細胞分裂素在低溫條件下根系合成的細胞分裂素上運受阻，因而地上部含量較低，但是目前關于細胞分裂素在植物開花中的作用中還有待進一步研究。此外，早春植物中較低的IAA 含量和較高的ABA 和GA含量也證明開花期間植物的激素調節(jié)趨于平衡，激素之間的這種平衡調控植物的開花過程。

圖4 早春開花植物和非早春開花植物中其他激素與ZT的比例Fig.4 The ratio of other hormones to ZT in early spring flowering plants and non-early spring flowering plants

植物激素可以調控植物的生長發(fā)育及其對環(huán)境的適應。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同植物激素之間存在大量的互作，并且每種激素作用的發(fā)揮取決于特定激素的組合，而不是單個激素的作用。在激素的信號轉導方面也是如此，植物激素的信號轉導途徑存在著復雜的交互作用，同一個調控蛋白也可能在多條信號途徑中起作用。DELLA 蛋白在GA 信號轉導途徑中作為核心負調控因子發(fā)揮功能，DELLA 蛋白還作為多個信號通路交叉互作的節(jié)點發(fā)揮功能，相關研究一直是熱點。擬南芥（）中的研究提供了由DELLA蛋白RGA介導的生長素和赤霉素信號串擾的直接證據(jù)。番茄（）中的研究表明果實萌發(fā)過程中生長素與赤霉素的信號串擾是通過SlDELLA 和SlARF7/SlIAA9 復合物介導的。兩者的協(xié)同作用對植株的生長調控具有重要意義，DELLA 蛋白可直接抑制PIF（PHYTO?CHROME INTERACTING FAC-TOR）蛋白的轉錄活性，而PIF蛋白對生長素的生物合成具有促進作用。同時，DELLA 蛋白在ABA 的合成與信號轉導中也發(fā)揮著重要作用。于磊研究表明，水曲柳中DELLA 可促進ABA 的生物合成并在逆境條件下增強ABA 信號轉導。我們的研究也表明，在早春開花植物中，GA 和ABA 的含量較高時，IAA會有所降低，進一步證明激素在信號轉導過程中存在互作。

植物中的大多數(shù)酚類物質都是通過莽草酸途徑合成的，并以-苯丙氨酸為前體物質。早春開花植物中的-苯丙氨酸相對含量顯著高于非早春開花植物，說明酚類化合物積極參與了植物開花這一生理過程。Dai 等曾發(fā)現(xiàn)用苯丙氨酸拮抗劑DL-P-氟代苯丙氨酸處理不同時期的日本牽?；?，會抑制其開花，與本研究一致。C6C1 骨架的酚類化合物香草酸、丁香酸和原兒茶酸在早春開花植物中的相對含量較低，而龍膽酸和苯甲酸在開花植物中顯著積累。原兒茶酸是植物多酚（如花青素）的主要酚類代謝產物，在早春開花植物中觀察到原兒茶酸的相對含量較低，多酚含量在早春開花植物中可能也積累較少。有研究表明，苯甲酸、肉桂酸在大麥根對磷和鉀等營養(yǎng)元素的吸收過程中起阻抑作用，且香豆素和苯甲酸使大麥胚的蔗糖含量增加，說明苯甲酸與糖類合成關系密切，本研究中苯甲酸在早春開花植物中顯著積累，可以推測早春開花植物中糖類含量的增加。具有C6C3 骨架的化合物對羥基肉桂酸、迷迭香酸，以及肉桂酸在早春開花植物中顯著積累，而阿魏酸、綠原酸和咖啡酸在開花植物中含量較低。有研究發(fā)現(xiàn)-香豆酸和肉桂酸可以使氧化磷酸化與呼吸鏈的偶聯(lián)遭到破壞，進而影響植物的呼吸作用。在我們的研究中，早春開花植物中肉桂酸含量的積累可能與其在低溫環(huán)境中呼吸速率降低有一定關系。本研究發(fā)現(xiàn)具有C6C3C6 結構的酚類化合物占最大比例，這些酚類化合物通常被歸類為與植物花瓣顏色以及授粉相關的黃酮類物質。在本研究中，蘆丁、柚皮苷、甘草素、大豆苷元和異檞皮苷在早春開花植物中顯著積累，而柚皮素、染料木苷、染料木素、橙皮素、白楊素、高良姜素和芹菜素在開花植物中含量較低。染料木苷、橙皮素、白楊素和高良姜素在非早春開花植物中有較多分布，這可能是由于它們在早春植物的開花過程中發(fā)揮了作用而引起了大量損耗，例如芹菜素。芹菜素是一種天然的黃酮類化合物，之前有研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可能承擔開花期間吸引傳粉者的任務。本研究觀察到芹菜素在兩類植物中的分布差異很大，在未開花植物中積累較多，可能是由于早春開花植物將大量芹菜素用于授粉而導致的。目前關于植物中酚類化合物的研究報道很多，但同時針對多個物種類型的酚類化合物分析卻很少。我們的研究發(fā)現(xiàn)，早春開花植物和非早春開花植物在酚類代謝物的分布上有很大差異，正是這種差異導致了早春開花植物通過外界低溫環(huán)境的刺激而完成開花調控，處在相同環(huán)境的未開花植物卻仍處于營養(yǎng)生長階段。這不僅有助于我們進一步了解早春開花植物的開花策略，同時也對早春植物的深入研究具有重要意義。

4 結論

本研究通過對早春開花植物與非早春開花植物的內源激素比值以及酚類代謝物含量進行綜合分析，進而了解早春開花植物在低溫環(huán)境下開花的生理特征。研究結果表明，早春開花植物中的IAA 和ZT 含量明顯低于非早春開花植物中的IAA含量，而GA和ABA 含量較高。另外，酚類代謝物的前體物質-苯丙氨酸在早春開花植物中含量較高，表明酚類化合物積極響應了早春植物開花這一過程；同時，C6C1 骨架化合物香草酸、丁香酸和原兒茶酸，C6C3 骨架化合物阿魏酸、綠原酸和咖啡酸，以及黃酮類化合物芹菜素、染料木苷、橙皮素、白楊素和高良姜素在未開花植物中有較多分布，這可能是由于它們在早春植物的開花過程中發(fā)揮了作用而引起了大量損耗。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們對早春開花植物的進一步認識，并為早春開花植物的鑒定、人工生產、栽培和開發(fā)利用奠定了理論基礎。