王雪瑩 王瑞琪 張 洋 劉 聰 夏德安 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 國家林業(yè)與草原局鹽堿地研究中心，中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091）

環(huán)核苷酸門控離子通道（cyclic nucleotide-gat?ed channels，CNGC）是非選擇性陽離子通道，其C端的環(huán)核苷酸結(jié)合域（cyclic nucleotide binding do?main，CNBD）可以與環(huán)磷酸腺苷（cAMP）或環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）這兩種信號分子結(jié)合，從而介導(dǎo)單價(jià)或雙價(jià)陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，故因此得名為CNGC。在植物界中，CNGC 可將鈣離子、鉀離子導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，從而影響植物的生長發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)。1998年，植物中的環(huán)核苷酸門控離子通道首次在大麥（）中被確認(rèn)。此后，家族在擬南芥（、煙草（）、水稻（）、玉米（）、番茄（）和 梨（）等植物中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)擬南芥家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可將20 個(gè)家族成員分為4 個(gè)亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中Ⅳ亞群包括Ⅳa亞組和Ⅳb亞組。植物CNGC的核心結(jié)構(gòu)由6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（S1～S6）組成，其中S5 與S6 之間有1 個(gè)由20～30 個(gè)氨基酸組成的孔狀結(jié)構(gòu)（P-loop，P 環(huán)），其肽鏈的C 端具有環(huán)核苷酸結(jié)合域及鈣調(diào)素結(jié)合域（calmodulin binding domain，CaMBD），并且兩者有部分重疊，在植物家族中，CNBD 最保守的區(qū)域是磷酸鹽結(jié)合域（phos?phate binding cassette，PBC）和鉸鏈區(qū)（hinge region，HR），它們是植物家族成員的重要標(biāo)志。

研究發(fā)現(xiàn)，植物家族在植物的生長發(fā)育及應(yīng)對多種生物與非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。例如，過表達(dá)使煙草的花粉管變寬、變短；水稻能夠促進(jìn)植株花粉管通道內(nèi)的細(xì)胞程序性死亡從而促進(jìn)花粉管的生長。此外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因參與植物抗??；煙草基因可以抵抗煙草青枯病菌的侵染，這表明家族在促進(jìn)植物免疫中也起到重要作用。此外，蓖麻（）在鹽脅迫處理下時(shí)，起到重要的信號傳導(dǎo)作用。由此可見，家族廣泛存在于植物中，參與植物的生長發(fā)育，對植物的逆境脅迫響應(yīng)也有著重要作用，在植物的生命周期中不可或缺。

2006 年，毛果楊（）被基因組測序，可作為木本研究的模式植物。目前有關(guān)毛果楊基因的信息較為缺乏。因此，在全基因組水平上對毛果楊家族進(jìn)行鑒定與分類具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)手段在毛果楊中鑒定出19個(gè)家族成員并對其進(jìn)行分析，包括其基因結(jié)構(gòu)、蛋白基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守基序分布以及分析了有關(guān)植物激素響應(yīng)和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，并利用qRT-PCR 分析毛果楊在不同組織中家族的表達(dá)模式，目的是為研究該家族在滲透脅迫過程中的作用提供參考。為進(jìn)一步了解毛果楊家族的進(jìn)化關(guān)系及生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。同時(shí)，為后續(xù)深入開展植物家族的滲透脅迫研究提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用的毛果楊來自中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將毛果楊進(jìn)行擴(kuò)繁，選取生長1 個(gè)月大小、且長勢一致的毛果楊組培苗移栽到土壤中，在溫室環(huán)境為（25±2）℃，長日照（光照16 h/黑暗8 h）下培養(yǎng)3 個(gè)月，分別采集毛果楊的根、莖和葉，液氮速凍并置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。此外，將溫室中培養(yǎng)1 個(gè)月、大小且長勢一致的毛果楊組培苗分別進(jìn)行100 mmol?LNaCI和8%PEG-6000處理。每種脅迫分別處理6、12、24、48、72 h，同時(shí)用水處理作為對照組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別采集各處理組植株材料的根、莖和葉，液氮速凍并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2毛果楊CNGC家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

利用已報(bào)道的擬南芥家族的蛋白序列比對Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov）中的毛果楊數(shù)據(jù)庫，初步獲得毛果楊家族的候選基因。將候選基因提交至Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、SMART（http：//smart.embl-heidel?berg.de/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/wrpsb. cgi）、PROSITE（https：//prosite. ex?pasy.org/）在線蛋白數(shù)據(jù)庫分析其結(jié)構(gòu)域，以含有CNBD 結(jié)構(gòu)域及同時(shí)含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ion trans?porter，ITP）結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrance domain，TM）為條件進(jìn)行篩選，同時(shí)利用BioEdit 軟件進(jìn)行多序列比對，以具有CNBD 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PBC 和HR 為標(biāo)準(zhǔn)，最終鑒定出毛果楊家族的全部成員。

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫獲得家族成員的染色體位置和基因序列等信息，根據(jù)基因所在的染色體號及位置對C 家族成員進(jìn)行命名；利用在線軟件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測PtrCNGC蛋白理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)、蛋白分子量和等電點(diǎn)等；使用TBtools軟件對染色體位置信息進(jìn)行可視化處理；通過YLoc 網(wǎng)站（https：//abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi）在線預(yù)測家族成員的亞細(xì)胞定位信息。

1.3毛果楊CNGC家族系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 6.0軟件中的ClustaW 程序?qū)㈣b定出的毛果楊家族成員的蛋白序列與擬南芥、水稻和梨的家族成員的蛋白序列進(jìn)行多重比對。采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 參數(shù)設(shè)置為1 000。將得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹數(shù)據(jù)經(jīng)iTOL 網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行可視化處理。

1.4毛果楊CNGC 家族同源基因的Ka/Ks比值分析

利用NCBI中的BLAST在線網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），比對毛果楊家族成員之間的CDS 序列，其序列的相似性超過80%則認(rèn)為具有同源性。利用TBtools 軟件計(jì)算同源基因之間的同義替換率（synonymous substitu?tions rates，）、非同義替換率（nonsynonymous sub?stitution rates，）以及/比值。當(dāng)/>1，認(rèn)為有正選擇效應(yīng)；/=1，認(rèn)為存在中性選擇；/<1，則認(rèn)為有純化選擇作用。

1.5毛果楊CNGC 家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

利用TBtools軟件將的外顯子—內(nèi)含子信息進(jìn)行可視化?；虮Ｊ鼗颍∕otif）由在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析獲得，使用默認(rèn)參數(shù)。并利用在線網(wǎng)站W(wǎng)ebLogo（http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi）對Motif進(jìn)行可視化處理。最后利用BioEdit 軟件對家族的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，對其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.6毛果楊CNGC 基因家族啟動子區(qū)順式作用元件分析

在Phytozome 網(wǎng)站上下載家族基因起始密碼子上游2 000 bp 的序列作為啟動子序列信息，利用在線網(wǎng)站PlantCare（http：//bioinformat?ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行順式作用元件在線預(yù)測分析，最后利用TBtools 軟件對其位置進(jìn)行可視化。

1.7毛果楊CNGC 基因家族組織表達(dá)特異性及鹽脅迫和PEG脅迫響應(yīng)特異性分析

使用植物總RNA 提取試劑盒（MiniBEST，Ta?KaRa）提取總RNA，然后利用PrimeScriptRT re?agent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 用于qRT-PCR。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)家族基因定量引物，以為內(nèi)參基因（見表1）。使用賽默飛ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行試驗(yàn)，體系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Supermix 10.0 μL、上下游混合引物（10 μmol·L）0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，加ddHO至20.0 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，循環(huán)40 次；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s。每組處理重復(fù)3 次，最后采用2法計(jì)算相對表達(dá)量并利用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

表1 毛果楊CNGC家族基因qRTPCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR of PtrCNGC gene family

2 結(jié)果與分析

2.1毛果楊CNGC家族成員的基因鑒定

CNBD 是植物家族的典型結(jié)構(gòu)域，尤其是存在于CNBD 區(qū)域內(nèi)的PBC 和HR。為了確認(rèn)CNBD 結(jié) 構(gòu) 域，使 用5 個(gè) 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫（Pfam、SMART、CDD、PROSITE和SurperFamily）對家族的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（見表2）。同時(shí)使用多序列對比方法檢查各序列CNBD 中的PBC 和HR（見圖3）。最終在毛果楊中鑒定出19 個(gè)。家族除了具有主要的結(jié)構(gòu)域外，其中、和還具有含IQ 基序（IQxxxRGxxxR，Pfam00612）的鈣調(diào)素蛋白結(jié)構(gòu)域。

表2 毛果楊CNGC基因家族結(jié)構(gòu)域Table 2 Domain architecture of PtrCNGC gene family

2.2毛果楊CNGC家族成員及其理化性質(zhì)分析

經(jīng)鑒定在毛果楊基因組中共篩選出19 個(gè)家族成員，并根據(jù)家族成員所在的染色體號及位置對其進(jìn)行命名（見表3）。19 個(gè)的基本特征如表3 所示：家族的蛋白長度為684～785 個(gè)氨基酸，這些蛋白的分子 質(zhì) 量 在78.532 21～89.681 54 kDa，pI 為7.53～9.55，19 個(gè)家族成員全部為堿性蛋白，此外，除PtrCNGC17.3為疏水性蛋白，其余成員均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析顯示，除PtrCNGC17.1分布在過氧化物酶體上，其余PtrCNGC 蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)中。

表3 毛果楊CNGC 家族概況Table 3 Summary of PtrCNGC gene family

2.3毛果楊CNGC家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將鑒定得到的19 個(gè)毛果楊PtrCNGCs 的氨基酸序列與20 個(gè)擬南芥AtCNGCs、16 個(gè)水稻Os?CNGCs，以及21 個(gè)梨PbrCNGCs的氨基酸序列進(jìn)行比對，采用ML 法共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖1 參考擬南芥家族的聚類結(jié)果，可將毛果楊家族分成4 個(gè)亞群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ（Ⅳa、Ⅳb）。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，毛果楊、擬南芥、水稻和梨在5 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa 和Ⅳb）中分別含有20、13、21、9和13個(gè)成員，其中毛果楊家族中的亞群Ⅰ含有4 個(gè)成員；亞群Ⅱ含有3 個(gè)成員；亞群Ⅲ含有的成員數(shù)最多為6 個(gè)；亞組Ⅳa 和Ⅳb 都各含有3 個(gè)成員。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在家族亞群Ⅲ含有的成員最多，亞組Ⅳa含有的成員最少。進(jìn)化樹分析表明，毛果楊與擬南芥和梨的親緣關(guān)系較近，與水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這或許與水稻為單子葉植物而毛果楊與擬南芥和梨共為雙子葉植物有關(guān)。

圖1 毛果楊與擬南芥、水稻和梨的CNGC家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹藍(lán)色三角、黃色三角、紅色方形和綠色圓形分別代表毛果楊、擬南芥、水稻和梨，分支上的數(shù)值代表Bootstrap 1 000 個(gè)循環(huán)的置信度（只顯示50%以上的置信度）Fig.1 Phylogentic Tree of CNGC gene family from Populus trichocarpa（Ptr），Arabidopsis thaliana（At），Oryza sativa（Os）and Pyrus bretchneider（iPbr）Blue triangle，yellow triangle，red square and green circle represent Populus trichocarpa，Arabidopsis thaliana，Oryza sativa and Pyrus bretchneideri，the numbers represent the percentage of 1 000 Bootstrap replication（sonly above 50%showed）

2.4毛果楊CNGC 家族成員染色體定位以及同源基因的Ka/Ks比值分析

家族成員染色體分布情況如圖2 所示，2號、3號、6號、9號、13號和14號染色體上有1個(gè)基因，1號和12號染色體上有2個(gè)基因，15號、17號和18 號染色體上各有3 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)19 個(gè)家族成員在染色體上呈不均勻分布，有8個(gè)染色體上沒有該家族成員分布。

圖2 PtrCNGC家族基因染色體定位及同源關(guān)系紅色線連接有同源關(guān)系的同源基因Fig.2 Chromosome distribution of PtrCNGC gene familyThe line connects the homologous genes

利 用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi？ PROGRAM=blastn & PAGE_TYPE =BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）對家族成員的核苷酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示（見表4），和、和、和、和、和以及、和之間的序列相似性超過80%，表明具有同源關(guān)系，且上述各具基因?qū)κ怯捎诨驈?fù)制事件進(jìn)化形成旁系同源基因。其中和共 在15 號 染 色 體上，且物理距離小于200 kb，表明發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)。

為了闡明選擇壓力在家族進(jìn)化中的作用，利用TBtools 軟件分析了家族同源基因的值、值和/值。結(jié)果表明（見表4），家族7 對同源基因的/值均遠(yuǎn)小于1，表明家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇。

表4 同源基因的Ka/Ks比值及同源性Table 4 Ka/Ks ratio and homology of homologous genes

2.5毛果楊CNGC 家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序的分析

CNBD 是植物CNGC 中典型的結(jié)構(gòu)域，如圖3所示其保守基序?yàn)長-X2-G-［DNG］-［FV］-X-G-［ED］-L-［LF］-X-W-X-L-X（10，20）-S-X（2）-T-X（7）-E-A-F-X-L，該基序與其他植物基本吻合。如圖3 所示谷氨酸（E）、丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）和亮氨酸（L）在HR 中是保守的（100%），亮氨酸（L）、甘氨酸（G）和色氨酸（W）在PBC 中是保守的（100%），與其他植物相比，家族中HR 的保守性無明顯差異，但PBC 較其他植物表現(xiàn)得更為保守。

圖3 PtrCNGC蛋白CNBD中PBC和HR頂部圖形代表了PtrCNGC 蛋白的3 個(gè)區(qū)域：TM、CNBD 和CaMBD；星號表示19 個(gè)PtrCNGC 成員之間氨基酸100%保守，綠色和紅色區(qū)域分別代表PBC和HRFig.3 The PBC and the HR within the CNBD of PtrCNGC proteinsThe diagram at the top represents three regions of PtrCNGC proteins：TM，CNBD and CaMBD；The asterisk indicate 100% identity among the 19 PtrCNGCs；green and red regions represent the PBC and HR

分析了19個(gè)家族成員的外顯子—內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)分布（見圖4），結(jié)果顯示，家族中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞群以及Ⅳa 亞組中成員外顯子的數(shù)量為6～8 個(gè)，而Ⅲ亞群中的的外顯子數(shù)量最少僅有2 個(gè)，Ⅳb 亞組中外顯子的數(shù)量最多且均為12 個(gè)，發(fā)現(xiàn)位于同一分支上的家族成員的外顯子數(shù)量接近。此外、和的外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分布與其他成員存在較大差異，表明在進(jìn)化過程中可能存在基因結(jié)構(gòu)變異。

圖4 PtrCNGC家族基因的外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Exon-intron structure of PtrCNGC gene family

為進(jìn)一步研究毛果楊家族的特征，使用MEME 對其蛋白保守基序進(jìn)行了分析（見圖5）。結(jié)果顯示，家族編碼蛋白的10 個(gè)保守基序（Motif 1～10）中，同一亞群及同一亞組的成員保守基序的位置分布相似。19個(gè)成員具有9 個(gè)共同的基序，表明這些基序在家族中具有重要作用。此外缺失了基序4，而具有2 個(gè)基序4，說明家族基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)在具有保守性的同時(shí)，功能上也存在一定差異。

圖5 PtrCNGC家族蛋白保守基序分析Motif 1～10用不同的顏色表示；Motif 1～10序列展示在下方Fig 5 The protein conserved motif of PtrCNGC gene familyMotif 1-10 are indicated by different colors；The sequences of the motifs 1-10 are shown below

2.6毛果楊CNGC家族啟動子特征分析

通過PlantCARE 數(shù)據(jù)庫分析，在的啟動子區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的順式作用元件，其中包括多種響應(yīng)非生物脅迫及植物激素的順式作用元件。結(jié)果（見圖6）表明，在毛果楊家族中發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)非生物脅迫的元件有厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）、干旱響應(yīng)元件（MBS）、光響應(yīng)元件（Gbox）、低溫響應(yīng)元件（LTR），以及響應(yīng)光、鹽、低溫的元件（AE-box）；響應(yīng)植物激素的元件包括水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、赤霉素響應(yīng)元件（P-box），以及生長素響應(yīng)元件（TGA-element）。這些結(jié)果說明家族成員極有可能被鹽、干旱、低溫和生長素等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明毛果楊家族在非生物脅迫以及激素響應(yīng)中可能具有重要作用。

圖6 PtrCNGC族啟動子區(qū)順式作用元件Fig.6 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of PtrCNGC gene family

2.7毛果楊CNGC 家族在各組織中的表達(dá)模式分析

通過qRT-PCR 對毛果楊基因家族成員在根、莖和葉中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果（見圖7）表明，在家族中，有13 個(gè)成員在莖中表達(dá)量最高，4 個(gè)成員在葉中表達(dá)量最高，而僅有2個(gè)成員在根中表達(dá)量最高，表明家族的多數(shù)成員在毛果楊莖中表達(dá)量較高，而在根和葉中表達(dá)量較低。此外，發(fā)現(xiàn)同一分支的多數(shù)成員在不同組織中的表達(dá)模式相似。

圖7 PtrCNGC基因組織表達(dá)特異性分析Fig.7 Tissue-specific expression analysis of PtrCNGC gene family

2.8毛果楊CNGC 家族在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

進(jìn)一步了解家族的非生物脅迫響應(yīng)特性，對鹽脅迫下的家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。如圖8 所示，在根中，多數(shù)家族成員在24 或48 h 表達(dá)量最高，而Ⅳb 亞組成員隨時(shí)間的增加表達(dá)量呈下降趨勢且在0 h 時(shí)表達(dá)量最高。在莖中，多數(shù)家族成員在脅迫處理6 h 的表達(dá)量最高，在72 h 時(shí)表達(dá)量最低。在葉中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞群以及Ⅳa亞組中的多數(shù)成員在脅迫處理24 或48 h 時(shí)表達(dá)量最高，而Ⅳb 亞組中的在0 h時(shí)表達(dá)量最高、和分別在12 和24 h 表達(dá)量最高。說明家族成員在植物不同組織中對鹽脅迫的響應(yīng)程度不同，可能在毛果楊響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。

圖8 鹽處理下PtrCNGC基因的表達(dá)水平分析Fig.8 Analysis of expression level of PtrCNGC gene family in salt treatment

2.9毛果楊CNGC 家族在PEG 脅迫下的表達(dá)模式分析

利用PEG模擬干旱脅迫下家族成員的表達(dá)情況如圖9所示，在根中，Ⅱ亞群全部成員與Ⅲ亞群中的、、及Ⅳa 亞組中的在0 h時(shí)表達(dá)量最高；Ⅳb 亞組中的全部成員與亞群Ⅰ中的和、Ⅳa 亞 組 中和、Ⅳb 亞組中在脅迫處理24 h 時(shí)表達(dá)量最高。在莖中，多數(shù)家族成員在脅迫處理0 或6 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，而Ⅳb 亞群中的所有成員均在脅迫處理48 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。在葉中，多數(shù)r家族成員在脅迫處理48 或72 h 時(shí)表達(dá)量最高，且隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢。結(jié)果表明19個(gè)成員均在PEG 處理后有不同程度的響應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)同一分支上的多數(shù)成員表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。

圖9 PEG處理下PtrCNGC基因的表達(dá)水平Fig.9 Analysis of expression level of PtrCNGC gene family in PEG treatment

3 討論

家族基因廣泛存在于植物中，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)過程。本研究從毛果楊全基因組中共鑒定出19 個(gè)家族成員，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將毛果楊家族分為5 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa和Ⅳb），其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞群之間的親緣關(guān)系比較近，而第Ⅳ亞群與其他亞群的關(guān)系較遠(yuǎn)且2個(gè)亞組成員之間的距離也相對較遠(yuǎn)，這與此前擬南芥家族的研究結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，毛果楊CNGC 蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。而在水稻家族中，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)其多數(shù)成員分布在細(xì)胞質(zhì)膜上，且在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體類囊體膜和線粒體內(nèi)膜上也有分布。此外，現(xiàn)有研究結(jié)果表明多數(shù)擬南芥家族成員蛋白定位于細(xì)胞膜質(zhì)上，這與植物CNGC具有轉(zhuǎn)運(yùn)陽離子的能力以及含有TM、ITP等功能結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

此外，同一分支家族成員的蛋白保守基序分布及其數(shù)量基本一致，推測同一亞群成員的生物學(xué)功能具有相似性。在家族發(fā)現(xiàn)7 對旁系同源基因，表明基因復(fù)制事件在家族擴(kuò)張中起主要作用，基因復(fù)制可以增加基因的數(shù)量以及功能的多樣性。同時(shí)7 對同源基因的/比值均遠(yuǎn)小于1，說明這些相關(guān)基因是在較強(qiáng)的純化選擇下進(jìn)化而來的，根據(jù)已有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥和梨的家族經(jīng)歷了較強(qiáng)的正向選擇壓力，說明植物家族進(jìn)化方式存在差異。此外，Ⅳa 亞組全部的3 個(gè)成員互為旁系同源基因，說明該亞組在進(jìn)化過程中較為保守，其功能可能具有高度相似性。

毛果楊家族中Ⅳb亞組成員的外顯子數(shù)量最多，它們提高了發(fā)生選擇性剪接的可能性，從而增加了家族功能的多樣性。通過研究毛果楊家族在根、莖和葉中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在莖中的表達(dá)量較高，而在根和葉中的表達(dá)量較低，說明家族在不同組織中的表達(dá)具有特異性。此外，發(fā)現(xiàn)亞群Ⅱ中的在根中的表達(dá)量較高，莖和葉中的表達(dá)量較低，而亞群Ⅱ的其余兩個(gè)成員（和）在根和葉中表達(dá)量較高，莖中的表達(dá)量較低，同時(shí)根據(jù)家族基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子明顯長于和，因此推測此亞群成員在植物不同組織的表達(dá)情況或許與其基因結(jié)構(gòu)有關(guān)。

根據(jù)順式作用元件分析，家族成員含有數(shù)量不等的與響應(yīng)植物激素和非生物脅迫過程有關(guān)的順式作用調(diào)控元件，如干旱響應(yīng)元件（MBS），響應(yīng)光、鹽、低溫的元件（AE-box）等，推測它們在植物的生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫過程中起著重要作用。根據(jù)所研究的19 個(gè)在鹽脅迫與干旱脅迫下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)家族成員在相同脅迫處理下，同一分支上的成員表達(dá)模式相似，如在鹽脅迫處理下，在根中的Ⅱ亞群所有家族成員表達(dá)模式呈先上升后下降的趨勢，且均在脅迫處理48 h 時(shí)表達(dá)量最高。而在不同脅迫處理下，家族成員的表達(dá)模式不同，如亞群Ⅱ中的成員在根中的表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加而上升，達(dá)到峰值后開始下降，但在干旱脅迫處理下，其表達(dá)量明顯下降，表明家族在不同脅迫處理下的響應(yīng)能力不同。本研究為進(jìn)一步研究毛果楊家族響應(yīng)非生物脅的功能提供參考。