程曉亮，陳劍波*，王樹華，韓文儒，穆秀梅，淡江華

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，山西 太谷 030801)

養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的重要因素，豬舍內(nèi)有害氣體及懸浮粒子等環(huán)境污染物影響豬只生長發(fā)育，誘發(fā)多種疾病，造成嚴重經(jīng)濟損失。豬舍內(nèi)空氣中的微生物(細菌、真菌、病毒等)會附著在懸浮粒子上，所形成微生物氣溶膠成為豬氣源性疾病的主要誘因。研究證實，如非洲豬瘟、豬瘟、豬鏈球菌病等可通過氣溶膠實現(xiàn)短距傳播，豬口蹄疫、豬偽狂犬病、豬支原體肺炎等也可經(jīng)氣溶膠長距傳播。此外，如果攜帶人畜共患病病原體的氣溶膠向周邊居民區(qū)擴散，會造成嚴重的生物安全風險。

微生物氣溶膠作為豬舍內(nèi)氣載污染物的重要來源，已引起國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注。研究表明豬舍內(nèi)微生物氣溶膠和豬糞便中的微生物組成有較高相似性。隨著舍內(nèi)環(huán)境變化，氣溶膠中的微生物會快速適應(yīng)，產(chǎn)生時間及空間上的動態(tài)變化模式。如豬舍類型、飼養(yǎng)模式及季節(jié)變化等會導致舍內(nèi)空氣中細菌濃度存在差異。這些研究建立在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法之上，但其無法全面揭示豬舍內(nèi)微生物氣溶膠的豐富度和多樣性。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展及應(yīng)用，為豬舍空氣樣本中微生物的多樣性檢測提供了技術(shù)支撐。本研究以山西省某典型規(guī)模化豬場為研究對象，分別于不同季節(jié)對各類型豬舍內(nèi)空氣樣本進行采集，利用高通量測序技術(shù)對細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較分析，探索氣溶膠中的細菌在空間和時間上的分布、變化特征，以期為豬舍內(nèi)空氣質(zhì)量控制和豬場生物安全防控等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗豬場及飼養(yǎng)管理

選擇山西省晉中市介休市某規(guī)?；i場開展研究。該豬場存欄基礎(chǔ)母豬480余頭，其飼養(yǎng)規(guī)模、豬舍結(jié)構(gòu)、通風模式及管理水平在山西省乃至中國北方地區(qū)均具有代表性。豬舍采取東西走向，長約25 m，寬約8 m，高約3 m。保育豬舍共28欄，每欄6～8頭；育肥豬舍共10欄，每欄14～15頭；哺乳母豬舍存欄20頭母豬。半封閉式豬舍，舍頂部均勻分布3個通風口，自然采光及通風，冬季地暖保溫。豬只自由飲水，早晚人工清糞。

1.2 樣品采集與處理

分別于夏季(采樣時舍外溫度為27.3～34.0 ℃)、秋季(采樣時舍外溫度為18.3～18.7 ℃)、冬季(采樣時舍外溫度為-5.4～-1.5 ℃)進行豬舍內(nèi)氣溶膠的采集和處理。BX、BQ、BD分別代表保育豬舍的夏季、秋季、冬季空氣樣本，F(xiàn)X、FQ、FD分別代表育肥豬舍的夏季、秋季、冬季空氣樣本，MX、MQ、MD分別代表哺乳母豬舍的夏季、秋季、冬季空氣樣本。選用六級空氣微生物采樣器采集豬舍空氣樣本(JWL-S6型，北京先能技術(shù)開發(fā)有限責任公司，空氣流速率為28.3 L·min，采集時間為3 min)，選用玻纖膜(天津市領(lǐng)航實驗設(shè)備有限公司)為采樣介質(zhì)，采樣點為豬舍中間過道的中點位置，距地面高度為1.2 m(豬背高處)，每個采樣點設(shè)3個重復，采樣前后均需對采樣器進行消毒。玻纖膜空氣樣本采集后放入無菌凍存管中，并迅速投入液氮，帶回實驗室，于-80 ℃冰箱保存。

1.3 DNA提取與測序

將剪碎的玻纖膜空氣樣本放入裂解液中充分裂解，待樣本裂解完畢后，采用德國MN公司的NucleoSpin 96 Soil (4×96)試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，并用DNA 濃度檢測儀器測定基因組DNA的濃度，將符合測樣要求的細菌基因組DNA樣本送百邁克生物科技有限公司開展高通量測序。

以送檢DNA樣本作為PCR反應(yīng)模板，以338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'作為引物，擴增細菌基因組16S rRNA的v3～v4區(qū)域。將PCR產(chǎn)物純化、定量與均一化處理，形成測序文庫。選用Illumina HiSeq 2500平臺對質(zhì)檢合格文庫測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

優(yōu)化測序結(jié)果，將優(yōu)化序列(Tags)聚類，劃分OTUs(Operational taxonomic units)，揭示豬舍空氣樣本的細菌群落結(jié)構(gòu)；分別采用Mothur(version v.1.30)軟件和QIIME軟件對送檢樣本進行α多樣性(Alpha diversity)、β多樣性(Beta diversity)分析，比較不同季節(jié)及各類型豬舍內(nèi)氣溶膠中細菌多樣性方面存在的差異。此外，使用SPSS 24.0進行檢驗。當<0.05時，表示在95%的置信區(qū)間內(nèi)具有統(tǒng)計學上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

選用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，分別測得不同季節(jié)、各類型豬舍內(nèi)空氣樣本的序列數(shù)據(jù)。其中，共產(chǎn)生優(yōu)化序列1 524 972條，每個樣本至少產(chǎn)生43 145條優(yōu)化序列。以序列相似度97%為標準，將優(yōu)化序列劃分為OTUs，共產(chǎn)生OUTs為1 547個，不同樣本OTUs范圍為315～1 159個。

2.2 豬舍空氣中細菌α多樣性分析

對豬舍內(nèi)空氣樣本開展α多樣性指數(shù)分析，結(jié)果見表1，不同季節(jié)、各類型豬舍內(nèi)的空氣樣本均獲得99%以上的高覆蓋度，反映測序結(jié)果的全面性。在圖1中，隨著樣品序列數(shù)量的增加，Shannon指數(shù)稀釋曲線逐漸趨于平坦，OTUs不再隨著測序數(shù)量增加而增長。說明測序數(shù)量能夠代表空氣樣本中的大多數(shù)細菌信息，反映測序結(jié)果的真實性。

圖1 樣本Shannon指數(shù)稀釋曲線

由表1可以看出：各類型豬舍空氣中細菌的豐富度(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))均表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化趨勢，冬季>秋季>夏季。其中，育肥豬舍秋、冬兩季更替時菌群豐富度和多樣性指數(shù)變化顯著，冬季Chao1、ACE指數(shù)極顯著大于夏秋季(<0.01)，Shannon指數(shù)顯著大于夏秋季，Simpson指數(shù)顯著小于夏秋季(<0.05)；哺乳母豬舍夏、秋兩季更替時菌群豐富度和多樣性指數(shù)變化顯著，秋季Chao1、ACE、Shannon指數(shù)極顯著大于夏季，Simpson指數(shù)極顯著小于夏季(<0.01)。此外，由表2可見，秋季育肥豬舍菌群豐富度和多樣性指數(shù)均極顯著小于哺乳母豬舍(<0.01)；夏季保育豬舍菌群豐富度和多樣性指數(shù)略大于育肥豬舍、哺乳母豬舍，但差異不顯著(>0.05)。

表1 不同季節(jié)豬舍空氣樣本Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

表2 不同類型豬舍空氣樣本Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.3 豬舍空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

為進一步研究豬舍類型、季節(jié)變化對豬舍空氣中細菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)的影響，利用非度量多維尺度分析法(NMDS)對不同樣本的菌群結(jié)構(gòu)差異進行分析(圖2)。在所有豬舍空氣樣本中，冬季各樣本間距離較近，且單獨聚為一簇，而夏、秋季的樣本相互重疊。這說明冬季各類型豬舍間空氣樣本菌群結(jié)構(gòu)差異較小，且冬季樣本菌群特征明顯區(qū)分于其他季節(jié)。NMDS 分析的 stress 值為0.028，表明排序結(jié)果可信。

圖2 樣本NMDS分析圖

2.4 豬舍空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

在不同季節(jié)，各類型豬舍空氣樣本中共獲得細菌分為23個門，547個屬。

從表3可以看出：在門水平下，豬舍空氣中細菌主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等組成。優(yōu)勢菌門的相對豐度值均表現(xiàn)出季節(jié)性差異，秋、冬季節(jié)更替時變化明顯，夏、秋季節(jié)更替時則差異均不顯著(>0.05)。在保育豬舍，冬季變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度值均顯著大于夏、秋季(<0.05)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度值極顯著大于夏、秋季(<0.01)；厚壁菌門(Firmicutes) 相對豐度值顯著小于秋季(<0.05)，極顯著小于夏季(<0.01)。在育肥豬舍，冬季變形菌門(roteobacteria)相對豐度值顯著大于夏季(<0.05)；酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度值顯著大于夏、秋季(<0.05)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度值顯著大于秋季(<0.05)，極顯著大于夏季(<0.01)；厚壁菌門(Firmicutes) 相對豐度值顯著小于夏、秋季(<0.05)；在哺乳母豬舍，冬季變形菌門(roteobacteria)顯著大于夏季(<0.05)；酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度值均極顯著大于夏、秋季(<0.01)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度值顯著大于秋季(<0.05)，極顯著大于夏季(<0.01)；厚壁菌門(Firmicutes) 相對豐度值顯著小于夏、秋季(<0.05)。此外，從豬舍類型分析(表4)，各類型豬舍間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。在秋季，保育豬舍藍藻細菌門(Cyanobacteria)相對豐度值顯著小于哺乳母豬舍(<0.05)，其他優(yōu)勢菌門的相對豐度值均差異不顯著(>0.05)。

表3 不同季節(jié)豬舍空氣樣本門水平上的優(yōu)勢菌群占比

表4 不同類型豬舍空氣樣本門水平上的優(yōu)勢菌群占比

從屬分類水平挑選豐富度最高的前20個菌群作物種豐富熱圖。從圖3可以看出：豬舍空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性差異。在夏、秋季，___、乳酸桿菌屬()、葡萄球菌屬()為優(yōu)勢菌屬。在冬季，鞘脂單胞菌屬()、____6、___為優(yōu)勢菌屬。此外，從豬舍類型分析，各類型豬舍間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖3 屬水平上的物種豐度熱圖

將豬舍空氣中細菌相對豐度較高(在屬分類水平豐富度最高的前50個物種，且相對豐度值大于0.1%)的潛在動物病原菌屬進行整理，結(jié)果見表5。從表5可以看出：病原菌屬相對豐度值均表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性差異，夏、秋季高于冬季。其中，在保育豬舍，夏季埃希氏-志賀菌屬(-)、不動桿菌屬()相對豐度值顯著大于冬季(<0.05)，秋季棒狀桿菌屬(_1)、鏈球菌屬()相對豐度值顯著大于冬季(<0.05)；在育肥豬舍，夏季鏈球菌屬()、不動桿菌屬()相對豐度值顯著大于冬季(<0.05)；在哺乳母豬舍，夏季埃希氏-志賀菌屬(-)、鏈球菌屬()、葡萄球菌屬()、棒狀桿菌屬(_1)相對豐度值顯著大于冬季(<0.05)，秋季埃希氏-志賀菌屬(-)、不動桿菌屬()、假單胞菌屬()、梭狀芽孢桿菌屬(___1)相對豐度值顯著大于冬季(<0.05)。此外，從豬舍類型分析(見表6)，在夏季，各類型豬舍間葡萄球菌屬()相對豐度值均維持較高的水平，彼此差異不顯著(>0.05)；在夏季，育肥豬舍埃希氏-志賀菌屬(-)相對豐度值高于保育豬舍和哺乳母豬舍，但差異不顯著(>0.05)。

表5 不同季節(jié)豬舍空氣樣本優(yōu)勢菌屬中潛在病原菌分布情況

表6 不同類型豬舍空氣樣本優(yōu)勢菌屬中潛在病原菌分布情況

3 討 論

3.1 豬舍空氣中細菌多樣性分析

國內(nèi)前期關(guān)于豬舍內(nèi)微生物氣溶膠豐度變化規(guī)律的研究多基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。有研究表明豬舍類型、季節(jié)變化對氣溶膠中可培養(yǎng)的總需氧菌及致病菌數(shù)量有明顯影響。本人前期研究表明，保育豬舍總需氧菌濃度季節(jié)性變化趨勢為冬季顯著高于其他季節(jié)，夏季在部分時間點高于春、秋季。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，高通量測序技術(shù)在分析微生物氣溶膠的多樣性及豐度方面有著天然的優(yōu)勢。本研究利用高通量測序技術(shù)獲得豬舍空氣樣本總OTU數(shù)為1 547，不同樣本OTU數(shù)范圍為315～1 159。從季節(jié)變化上分析，豬舍空氣中細菌豐富度和多樣性指數(shù)表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性差異，冬季>秋季>夏季。有研究表明分娩豬舍內(nèi)小氣候變化特別是舍內(nèi)風速等環(huán)境因素對細菌氣溶膠的豐富度和多樣性有一定的影響。本研究試驗豬場位于山西省中部盆地，為典型大陸季風氣候，四季分明，秋冬季早晚溫差大。各類型豬舍均采取自然通風模式。在夏季，豬舍通過開窗通風實現(xiàn)降溫；進入秋季，天氣轉(zhuǎn)涼，哺乳母豬舍通風次數(shù)明顯減少，舍內(nèi)空氣中細菌豐富度及多樣性指數(shù)顯著升高；進入冬季，育肥豬舍也采取密閉保溫模式，其豐富度和多樣性指數(shù)也顯著升高。此外，從豬舍類型上分析，在夏、秋季，各類型豬舍間菌群豐富度和多樣性均存在明顯差異。有研究結(jié)果表明，除了通風因素外，舍內(nèi)其他環(huán)境因素的變化也會影響細菌的多樣性，即在相對封閉條件下，豬群飼養(yǎng)密度、舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生等可能是影響豬舍空氣中細菌豐富度及多樣性的重要因素。

3.2 豬舍空氣中優(yōu)勢菌群分析

通過細菌群落結(jié)構(gòu)分析，在不同季節(jié)，各類型豬舍空氣樣本中共獲得23個門，547個屬。在門水平下，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等為豬舍微生物氣溶膠樣本中的優(yōu)勢菌門。這與國內(nèi)相關(guān)報道較為一致。在屬水平下，豬舍空氣中的優(yōu)勢菌屬種類及相對豐度存在季節(jié)性差異，夏、秋季優(yōu)勢菌屬為___、乳酸桿菌屬()、葡萄球菌屬()等、冬季優(yōu)勢菌屬為鞘脂單胞菌屬()、____6、___等。張喜慶在豬舍內(nèi)氣溶膠樣本中發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、尤微菌屬為主要優(yōu)勢菌屬，同本研究結(jié)果存在差異，這可能與不同地區(qū)地理、氣候環(huán)境或試驗豬場在飼養(yǎng)方式、營養(yǎng)配方上存在的差異相關(guān)。此外，不同類型豬舍內(nèi)環(huán)境存在差異，導致豬舍內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)不同，本研究也發(fā)現(xiàn)，各類型豬舍間空氣中優(yōu)勢菌屬的相對豐度值存在差異，但大部分差異不顯著。

在豐度水平前50的細菌群落中發(fā)現(xiàn)文獻中已報道的病原菌，包括不動桿菌屬()、梭狀芽孢桿菌屬(___1)、棒狀桿菌屬(_1)、埃希氏-志賀菌屬(-)、假單胞菌屬()、葡萄球菌屬()、鏈球菌屬()等。病原菌不僅對畜禽以及養(yǎng)殖場工作人員的健康產(chǎn)生影響，也給養(yǎng)殖場的生物安全防控帶來巨大挑戰(zhàn)。其中，鏈球菌通過粘膜感染引起的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎甚至急性死亡，同時繼發(fā)多種呼吸道炎癥，是一種重要的人畜共患病病原。梭狀芽孢桿菌屬中的產(chǎn)氣莢膜梭菌和埃希氏-志賀菌屬中的大腸桿菌是引起仔豬細菌性腹瀉的常見病原體。葡萄球菌作為一種條件致病菌廣泛存在于畜禽舍空氣內(nèi)、動物體表，可誘發(fā)仔豬滲出性皮炎、呼吸道感染、腦膜炎、敗血癥等多種疾病。本研究發(fā)現(xiàn)豬舍空氣樣本中優(yōu)勢病原菌屬相對豐度值的季節(jié)性變化趨勢較一致，表現(xiàn)為夏、秋季明顯高于冬季，這與樣本的菌群豐富度及多樣性變化趨勢相反。雖然秋、冬季交替后病原菌屬的相對含量明顯下降，但考慮到冬季冷熱應(yīng)激以及有害氣體、粉塵濃度升高等因素造成的不利影響，豬群相對易感，此時仍需加強微生物氣溶膠特別是病原菌的有效控制，切斷疾病的傳播渠道，降低豬場生物安全風險。

4 結(jié) 論

豬舍空氣中細菌豐富度和多樣性表現(xiàn)出季節(jié)性變化趨勢，冬季>秋季>夏季；在夏、秋季，豬舍類型也是影響細菌多樣性的重要因素。豬舍空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為季節(jié)性差異，秋、冬季節(jié)更替時變化明顯，各類型豬舍間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。在豬舍空氣樣本的優(yōu)勢菌屬中發(fā)現(xiàn)大量潛在動物病原菌，并具有較明顯的季節(jié)性變化特征，豬場應(yīng)加強相應(yīng)的生物安全措施。