韓俊壘,邊紅芝,胡建平

河南省胸科醫(yī)院呼吸與危重癥一病區(qū),鄭州 450000

侵襲性真菌感染是指由各種真菌誘發(fā)的侵襲性感染。侵襲性真菌感染以侵襲性肺部真菌感染為主,以曲霉菌感染最常見(jiàn),可引起氣道黏膜及肺部的炎癥等[1]。曲霉菌廣泛存在于自然環(huán)境中,屬于條件致病菌,常寄生于宿主呼吸道,在其免疫力低下時(shí)致病,是免疫缺陷、危重癥等高危人群死亡的主要原因[2]。小檗堿是從傳統(tǒng)中藥黃連中提取的異喹啉類(lèi)生物堿。LIANG Y 等[3]的研究表明,小檗堿可改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷,KALMARZI R N 等[4]證明小檗堿具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用。侵襲性肺曲霉病的主要病理表現(xiàn)為肺部炎癥,且患者往往免疫力低下,故本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析小檗堿治療侵襲性肺曲霉病的作用及機(jī)制,為研發(fā)治療侵襲性肺曲霉病的新藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FlexiVent動(dòng)物肺功能儀(加拿大SCIREQ 公司);164-5050型電泳儀(美國(guó)Biorad公司)。

1.2 試藥

注射用環(huán)磷酰胺(規(guī)格:0.2 g,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023036,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%,武漢卡諾斯科技有限公司);兩性霉素B(規(guī)格:25 mg·支-1,國(guó)藥準(zhǔn)字H13020284,華北制藥股份有限公司);大鼠干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(interleukin 4,IL-4)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司;兔抗大鼠T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(T-box expressed in T-cells,T-bet),GATA 結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA-3),GAPDH 一抗,均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 菌株

煙曲霉菌株購(gòu)自寧波明舟生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,7周齡,體質(zhì)量為260～270 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,單籠飼養(yǎng),室溫為24 ℃～26 ℃,相對(duì)濕度為40%～60%,自然光照,自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)操作符合一般動(dòng)物倫理學(xué)實(shí)驗(yàn)原則。

2 方法

2.1 煙曲霉菌孢子懸液的制備

煙曲霉菌孢子接種在PDA 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)5 d,清洗培養(yǎng)基后,收集菌液過(guò)濾,在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),調(diào)整孢子懸液密度為1×108個(gè)·mL-1,保存于4 ℃,備用。

2.2 造模、分組和干預(yù)

50只大鼠建立侵襲性肺曲霉病大鼠模型[5]:腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將其固定在操作臺(tái)上,頭部抬高45°,經(jīng)氣管插管注入煙曲霉菌孢子懸液100 μL,保持大鼠直立3 min;接種煙曲霉菌孢子前5、1 d及接種后3、7 d,每日腹腔注射1次注射用環(huán)磷酰胺,劑量依次為75、60、50、40 mg·kg-1,誘導(dǎo)形成免疫抑制狀態(tài)。剩余10只大鼠設(shè)為健康組,用等體積生理鹽水代替煙曲霉菌孢子懸液與環(huán)磷酰胺,其余操作同上。接種煙曲霉菌3 d后取血,用ELISA 檢測(cè)血清半乳甘露聚糖(galactomannan,GM),GM≥0.8表示造模成功。排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡、GM 未達(dá)標(biāo)的大鼠,共有40只大鼠造模成功,隨機(jī)分為模型對(duì)照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。接種后3 d給藥干預(yù):小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組分別灌胃100、200 mg·kg-1·d-1小檗堿,陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射1.575 mg·kg-1·d-1兩性霉素B,模型對(duì)照組與健康組用等體積生理鹽水灌胃,連續(xù)干預(yù)5 d。干預(yù)期間死亡大鼠按數(shù)量另選補(bǔ)齊。

2.3 檢測(cè)大鼠肺功能參數(shù)

用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,于頸部正中取切口,暴露氣管,取倒“T”切口插管,用手術(shù)線(xiàn)系緊插管。將大鼠放入體描箱,連接呼吸機(jī),用Anires2005軟件導(dǎo)出大鼠肺容積變換、靜息通氣量。

2.4 ELISA檢測(cè)大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4含量

大鼠完成肺功能檢查后,氣管插管結(jié)扎左肺,用生理鹽水經(jīng)氣管套管灌注右肺組織,回抽3次獲得肺泡灌洗液,在4 ℃以1 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為10 cm,取上清。按照IFN-γ、IL-4 ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度,計(jì)算大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠肺功能病理學(xué)

用頸椎脫臼法處死大鼠,沿血管與氣管走向切取10 mm 厚的小塊,取病灶明顯組織分為2份,一份先置于液氮中冷凍,再置于-80 ℃中保存,待測(cè);一份用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、透明、包埋后,制成5 μm 厚的切片,進(jìn)行HE 染色,常規(guī)脫蠟至水,吹干,用蘇木素染色7 min,用鹽酸酒精分色,反藍(lán)30 s,用伊紅染色3 min,常規(guī)脫水、透明、封片。于顯微鏡下觀察各組大鼠肺部病理學(xué)。

2.6 胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)檢測(cè)

處死大鼠后,立即解剖取胸腺、脾臟,用生理鹽水洗凈,用濾紙吸干水分,稱(chēng)質(zhì)量,計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)(mg·g-1)=胸腺質(zhì)量(mg)÷大鼠體質(zhì)量(g)。脾臟指數(shù)(mg·g-1)=脾臟質(zhì)量(mg)÷大鼠體質(zhì)量(g)。

2.7 RT-PCR 檢測(cè)肺組織T-bet、GATA-3 mRNA的表達(dá)水平

取肺組織0.1 g,用Trizol試劑提取總RNA,用核酸定量?jī)x定量后取RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDAN 1 μg,進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè),引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序:42 ℃ 5min,95 ℃ 10 s,95 ℃ 5 s,57 ℃ 31 s,40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行瓊脂糖電泳,用凝膠成像系統(tǒng)掃描,用Quantity One V4.4軟件進(jìn)行定量分析,用2-△△Ct法計(jì)算大鼠肺組織中T-bet、GATA-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR 的引物序列Tab.1 The primer sequences of RT-PCR

2.8 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織中T-bet、GATA-3蛋白的表達(dá)水平

取肺組織0.1 g,加蛋白裂解液,在4 ℃以10 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為10 cm,取上清,提取總蛋白。用BCA 法測(cè)定蛋白濃度,加相應(yīng)體積loading buffer緩沖液,沸水浴變性10 min,取總蛋白樣品100 μg進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離,濕法轉(zhuǎn)膜,用質(zhì)量濃度為0.05 g·mL-1的脫脂奶粉封閉。加兔抗大鼠T-bet、GATA-3、GAPDH 一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,洗膜,加入ECL,顯色,用Gel-pro Application軟件分析目的條帶的灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,肺功能指標(biāo)、IFN-γ、IL-4含量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和T-bet、GATA-3 mRNA 與蛋白的表達(dá)水平等計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,且方差齊,以()表示,進(jìn)行單因素方差分析與LSD-t比較。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肺功能指標(biāo)

與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠肺容積變換和靜息通氣量減小(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽(yáng)性對(duì)照組肺容積變換和靜息通氣量增大(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of rat lung function indexes (n=10,)

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of rat lung function indexes (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.2 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的含量

與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量降低,IL-4的含量增多(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ的含量增多,IL-4 的含量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ的含量增多,IL-4的含量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ的含量增多,IL-4的含量降低(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4 含量的比較 (n=10,)Tab.3 Contents of IFN-γ and IL-4 in rat alveolar lavage fluid(n=10,)

表3 大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4 含量的比較 (n=10,)Tab.3 Contents of IFN-γ and IL-4 in rat alveolar lavage fluid(n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.3 大鼠肺部病理學(xué)

健康組大鼠肺部病理正常。與健康組比較,模型對(duì)照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺部病理均可見(jiàn)煙曲霉菌菌絲,呈絲狀分布,粗細(xì)均勻,有呈45°的分支,大部分菌絲有間隔,呈珊瑚狀排列。模型對(duì)照組煙曲霉菌感染彌漫全肺,菌絲分布密集,向四周擴(kuò)散,血管出血嚴(yán)重,可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組的感染灶局限于肺部邊緣,菌絲呈散在分布,感染部分有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),出血量較少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺部病理學(xué) (HE染色,×400)Fig.1 Pathology of the lungs of rats in each group (HE staining,×400)

3.4 大鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)

與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)降低(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)升高(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)升高(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽(yáng)性對(duì)照組胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)升高(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的比較 (n=10,)Tab.4 Rat thymus index and spleen index (n=10,)

表4 各組大鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的比較 (n=10,)Tab.4 Rat thymus index and spleen index (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

3.5 肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 的表達(dá)水平

與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠肺組織T-bet mRNA 的相對(duì)表達(dá)量降低,GATA-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組T-bet mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組T-bet mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽(yáng)性對(duì)照組T-bet mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較(n=10,)Tab.5 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 mRNA in rat lung tissue (n=10,)

表5 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較(n=10,)Tab.5 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 mRNA in rat lung tissue (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P＜0.05。

3.6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白的表達(dá)水平

與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠肺組織T-bet蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低,GATA-3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組T-bet蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05);與小檗堿低劑量組比較,小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組T-bet蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05);與小檗堿高劑量組比較,陽(yáng)性對(duì)照組T-bet蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,GATA-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表6、圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織中T-bet、GATA-3的蛋白表達(dá)量Fig.2 Western blot detection of T-bet and GATA-3 protein expression in lung tissue of rats in each group

表6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=10,)Tab.6 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 protein in rat lung tissue (n=10,)

表6 大鼠肺組織T-bet、GATA-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=10,)Tab.6 Comparison of relative expression of T-bet and GATA-3 protein in rat lung tissue (n=10,)

注:與健康組比較,*P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,&P＜0.05;與小檗堿低劑量組比較,#P ＜0.05;與小檗堿高劑量組比較,△P＜0.05。

4 討論

曲霉菌屬作為侵襲性肺曲霉病的致病菌,在日常生活環(huán)境中比較常見(jiàn),孢子易隨呼吸進(jìn)入呼吸道,故深部煙曲霉菌感染主要發(fā)生于肺部,患者多病情危重,死亡率高[6]。小檗堿是重要生物堿,Tew X N 等[7]的研究表明,小檗堿可控制慢性呼吸道炎癥性疾病炎癥中的免疫軸。目前關(guān)于小檗堿在治療呼吸系統(tǒng)炎癥疾病潛力方面的研究尚不多見(jiàn)。

煙曲霉菌孢子釋放的特殊物質(zhì)可損傷氣道上皮細(xì)胞,減弱纖毛運(yùn)動(dòng),影響肺功能[8]。本研究中,與健康組比較,模型對(duì)照組大鼠肺容積變換和靜息通氣量減小,提示煙曲霉菌損傷了大鼠的肺功能。小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組的大鼠肺容積變換和靜息通氣量大于模型對(duì)照組,提示小檗堿可減輕大鼠肺功能損傷,初步驗(yàn)證了小檗堿的作用。HE 染色結(jié)果顯示,造模大鼠肺部病理均可見(jiàn)煙曲霉菌菌絲,但與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠腹部的菌絲散在分布,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與血管出血均減少,進(jìn)一步表明小檗堿可減輕由煙曲霉菌造成的肺部損傷,改善肺部病理學(xué),這可能與其抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用有關(guān)。Th1/Th2細(xì)胞失衡,即Th2型反應(yīng)模式是侵襲性肺曲霉病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。IL-4 作為T(mén)h2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化,對(duì)誘導(dǎo)Th2細(xì)胞生成至關(guān)重要[9];TFN-γ由Th1細(xì)胞分泌,可抑制IL-4 誘導(dǎo)B 細(xì)胞IgG 和IgE的產(chǎn)生[10-11]。IL-4和TFN-γ的比例反映Th1/Th2細(xì)胞平衡,Th1細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫抗感染功能,Th2具有調(diào)節(jié)變態(tài)反應(yīng)功能,一般情況下二者互相消長(zhǎng)、約束,一旦平衡失調(diào)則可致病[12]。本研究的結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組比較,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠肺泡灌洗液IL-4水平降低、TFN-γ水平升高,表明小檗堿可解除Th2 細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2細(xì)胞失衡狀態(tài),恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫功能平衡。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)為評(píng)估免疫功能的常用指標(biāo),本研究中,小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)高于模型對(duì)照組,再次驗(yàn)證小檗堿具有調(diào)節(jié)免疫的作用。

Th1/Th2細(xì)胞分化受多因素影響,轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要[13]。T-bet、GATA-3分別為T(mén)h1和Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1類(lèi)或Th2類(lèi)細(xì)胞分化[14-15]。T-bet是新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,在胸腺、脾臟、肺等少數(shù)組織中表達(dá),可促進(jìn)Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞分泌多種抑炎因子,抑制肺部炎癥[16-17]。GATA-3 是鋅指蛋白GATA 家族成員,僅表達(dá)于Th2細(xì)胞,可促進(jìn)分化中或已分化的Th0細(xì)胞合成Th2細(xì)胞因子,促進(jìn)Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,從而調(diào)控釋放多種促炎因子,加重肺部炎癥[18-20]。本研究中,模型對(duì)照組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、健康組大鼠肺部T-bet mRNA與蛋白的表達(dá)水平依次升高,GATA-3 mRNA 與蛋白的表達(dá)水平依次下降,與大鼠肺泡灌洗液TFN-γ、IL-4水平變化的趨勢(shì)一致,表明小檗堿可能通過(guò)上調(diào)大鼠肺部T-bet蛋白、下調(diào)GATA-3 蛋白發(fā)揮治療作用。

綜上所述,小檗堿可能通過(guò)調(diào)節(jié)T-bet/GATA-3信號(hào)通路保護(hù)侵襲性肺曲霉病大鼠肺功能、恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞平衡。本研究為侵襲性肺曲霉病的治療提供了新選擇,但本研究仍有不足之處,如小檗堿可能存在其他作用途徑等,其保護(hù)肺功能更深層次的機(jī)制尚未可知,有待進(jìn)一步研究。