唐 靜 ,侯俊芳 ,郭 艷 ,李永海

1.開封市人民醫(yī)院婦科,開封 475002;2.開封市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,開封 475002;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,新鄉(xiāng) 453000

子宮腺肌病(adenomyosis,AM)好發(fā)于30～50歲的經(jīng)產(chǎn)婦,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)量過大、子宮不規(guī)則出血及不孕等[1]。研究表明,AM 的發(fā)生與子宮內(nèi)膜的腺體、基質(zhì)具有侵襲性密切相關(guān)[2],上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡學(xué)說備受關(guān)注。異鼠李素(isorhamnetin,Iso)屬黃酮類化合物,提取自沙棘、銀杏等的葉、花、果實(shí),具有降血脂、降血壓、抗炎、抗病毒及抗癌等作用,有研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。本研究通過構(gòu)建AM 小鼠模型,觀察Iso對其子宮異位內(nèi)膜侵襲性與子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響,并探討可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM325型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國美康公司);CX23型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);Glite UV 凝膠成像系統(tǒng)(江蘇偉禾生物科技有限公司)。

1.2 試藥

異鼠李素(上海西格生物科技有限公司);干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)ELISA 試劑盒均購自上海廣銳生物科技有限公司;Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(美國Abcam 公司);兔抗小鼠P53-273H、上皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)、p-EGFR、轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、p-STAT3 一 抗,均購自美國Assay Designs公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級未孕ICR 雌鼠60 只,8 周齡,體質(zhì)量為(32±3) g,ICR雄鼠25只,8周齡,體質(zhì)量為(40±4) g。均購自上海砥石生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2021-0003。

2 方法

2.1 構(gòu)建AM 模型

用異體垂體移植術(shù)構(gòu)建AM 模型[4]。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉雌鼠,分離腹部皮膚層與皮下肌層,游離子宮,確認(rèn)膀胱下子宮分叉位置。處死同周齡ICR雄鼠,開顱,取出垂體組織,分成2份,分別與少量生理鹽水混合后,經(jīng)套管針將垂體懸濁液0.5 mL推注至雌鼠右側(cè)宮腔,同時(shí)退出內(nèi)芯與針頭,將子宮放回腹腔中,常規(guī)預(yù)防感染,關(guān)腹。

2.2 分組及干預(yù)

從60只雌性未孕ICR 小鼠中隨機(jī)抽取10只作為對照組,其余50 只構(gòu)建AM 模型。構(gòu)建模型后3個(gè)月從建模小鼠中隨機(jī)抽取10只分離異位組織,經(jīng)HE染色觀察證實(shí)造模成功,其余40只隨機(jī)分為AM組,Iso低、中和高劑量組,每組10只。Iso低、中和高劑量組用質(zhì)量濃度5 g·L-1Iso+羧甲基纖維素鈉混懸液1 mL灌胃,劑量分別為25、50、100 mg·kg-1[5],對照組、AM 組用等體積質(zhì)量濃度5 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。每日1次,連續(xù)干預(yù)2個(gè)月。

2.3 檢測血清IFN-γ、IL-4水平

末次干預(yù)后次日,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,心臟采血0.8 mL,室溫靜置后以3 000 r·min-1離心分離血清。用ELISA 檢測血清IFN-γ、IL-4水平,按照試劑盒說明書中的步驟操作,測定490 nm處的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清IFN-γ、IL-4水平。

2.4 組織取材

血液采集完成后,頸椎脫臼處死小鼠,開腹剖取子宮,取子宮在位內(nèi)膜置于質(zhì)量濃度40 g·L-1的多聚甲醛中固定48 h,用自來水將固定液沖洗干凈,用酒精梯度脫水,依次用二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明、浸蠟包埋,用切片機(jī)切成厚4 μm 的切片用于Tunel染色;取子宮異位內(nèi)膜分為2份,一份同法切片用于HE 染色,一份保存于液氮中用于蛋白表達(dá)水平的檢測。

2.5 Tunel染色法檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率

取子宮在位內(nèi)膜切片,脫蠟水洗,加Tunel反應(yīng)混合液,37 ℃濕盒孵育1 h,用PBS沖洗,加堿性磷酸酶抗體,37 ℃孵育0.5 h,用PBS沖洗,加2滴堿性磷酸酯酶底物BCIP/NBT,室溫孵育20 min,用PBS沖洗,用蘇木素復(fù)染,脫水干燥,封片。陽性標(biāo)準(zhǔn)為顯微鏡下觀察到細(xì)胞核被染成棕色或棕黑色。每張切片任選5個(gè)不相鄰視野,以平均每1 000 個(gè)細(xì)胞中Tunel陽性細(xì)胞所占百分比為凋亡率,求均值。凋亡率=(陽性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%。

2.6 HE染色法觀察子宮異位內(nèi)膜侵襲性

取異位內(nèi)膜切片,常規(guī)脫蠟,用自來水沖洗,用蘇木精染液染色,用自來水沖洗,用鹽酸酒精沖洗3 s,再用自來水沖洗,用Scott藍(lán)化液反藍(lán),用自來水沖洗,用伊紅染液染色,經(jīng)常規(guī)脫水、透明,用中性樹膠封片,于光鏡下觀察子宮異位內(nèi)膜侵襲性。根據(jù)AM 5級標(biāo)準(zhǔn)分級方式觀察子宮內(nèi)膜侵襲性:正常子宮為0分;內(nèi)膜間質(zhì)向肌肉內(nèi)層侵入為1分;內(nèi)膜間質(zhì)及腺體向肌肉內(nèi)層侵入為2分;內(nèi)膜組織向內(nèi)外肌層交界位置侵入為3分;內(nèi)膜腺體囊性增生,并可觀察到漿膜下結(jié)節(jié)為4分。

2.7 免疫印跡法檢測子宮內(nèi)膜組織相關(guān)蛋白表達(dá)量

取保存于液氮中的子宮異位內(nèi)膜組織,加入PBS勻漿,用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解,提取總蛋白,離心取上清,用BCA 試劑盒進(jìn)行定量檢測。取50 μg待測蛋白,混合5倍體積上樣緩沖液,沸水浴10 min,離心、電泳、轉(zhuǎn)至PVDF 膜,加入質(zhì)量濃度50 g·L-1脫脂奶粉,置于搖床中(室溫)封閉2 h,洗滌后加入兔抗小鼠 P53-273H、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,加入山羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000),常溫孵育2 h,洗滌后加入ELC發(fā)光液,暗室曝光,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行分析。蛋白的相對表達(dá)量=待測蛋白條帶的灰度值÷GADPH 條帶的灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血清IFN-γ、IL-4水平比較

與對照組比較,AM 組血清IFN-γ水平降低,IL-4水平升高(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組血清IFN-γ水平升高,IL-4水平降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 (n=10,)Tab.1 Comparison of serum IFN-γ and IL-4 levels in each group (n=10,)

表1 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 (n=10,)Tab.1 Comparison of serum IFN-γ and IL-4 levels in each group (n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

3.2 子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較

與對照組比較,AM 組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)。結(jié)果見表2、圖1。

表2 各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of apoptosis rate of endometrial cells in each group (n=10,)

表2 各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較 (n=10,)Tab.2 Comparison of apoptosis rate of endometrial cells in each group (n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

圖1 Tunel染色檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況 (×400)Fig.1 Endometrial cell apoptosis detected by Tunel staining (×400)

3.3 子宮異位內(nèi)膜侵襲性比較

與AM 組比較,Iso低劑量組子宮異位內(nèi)膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組子宮異位內(nèi)膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組子宮異位內(nèi)膜侵襲性評分降低(P＜0.05)。

結(jié)果見表3、圖2。

圖2 HE染色檢測子宮異位內(nèi)膜侵襲性 (×200)Fig.2 HE staining to detect the invasiveness of ectopic endometrium (×200)

表3 各組異位內(nèi)膜侵襲性比較 (n=10,)Tab.3 Comparison of ectopic endometrium invasiveness in each group (n=10,)

表3 各組異位內(nèi)膜侵襲性比較 (n=10,)Tab.3 Comparison of ectopic endometrium invasiveness in each group (n=10,)

注:與AM 組比較,aP＜0.05;與Iso低劑量組比較,bP＜0.05;與Iso中劑量組比較,cP＜0.05。

3.4 子宮內(nèi)膜組織中P53-273H 蛋白表達(dá)量,p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較

與對照組比較,AM 組P53-273H 蛋白的表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3升高(P＜0.05);與AM 組比較,Iso低劑量組P53-273H 蛋白的表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3降低(P＜0.05);與Iso低劑量組比較,Iso中劑量組P53-273H 蛋白表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3降低(P＜0.05);與Iso中劑量組比較,Iso高劑量組P53-273H 蛋白的表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3 降低(P＜0.05)。結(jié)果見表4、圖3。

圖3 免疫印跡法檢測子宮內(nèi)膜組織中P53-273H、p-EGFR、EGFR、p-STAT3、STAT3蛋白的表達(dá)量Fig.3 Expression of P53-273H,p-EGFR,EGFR,p-STAT3,STAT3in endometrial tissue by Western blot

表4 大鼠子宮內(nèi)膜組織中P53-273H 蛋白表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較 (n=10,)Tab.4 Comparison of P53-273H protein expression,p-EGFR/EGFR and p-STAT3/STAT3 in rat endometrium(n=10,)

表4 大鼠子宮內(nèi)膜組織中P53-273H 蛋白表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3的比較 (n=10,)Tab.4 Comparison of P53-273H protein expression,p-EGFR/EGFR and p-STAT3/STAT3 in rat endometrium(n=10,)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與AM 組比較,bP＜0.05;與Iso低劑量組比較,cP＜0.05;與Iso中劑量組比較,dP＜0.05。

4 討論

AM 是一種常見的婦科良性疾病,通常認(rèn)為其病因與子宮內(nèi)膜黏膜下層缺失、基底層在刺激下向深層及平滑肌束間侵襲、影響間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞功能有關(guān),伴有浸潤、血管增殖、種植及黏連周圍組織等腫瘤特性[6-7]。目前AM 保守治療藥物易引起雌激素水平降低,用藥時(shí)間及范圍限制較大,且停藥后容易復(fù)發(fā)[8]。因此,探究AM 異位內(nèi)膜侵襲性及子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,研究相對安全的中藥單體對該病的治療十分必要。

IFN-γ是輔助T1樣細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞被激活后釋放的單糖蛋白,可間接活化巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞,增強(qiáng)其吞噬能力及抗病毒能力,是機(jī)體重要的免疫調(diào)控因子[9]。

IL-4是Th2細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子,研究表明其在AM 患者外周血及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平明顯升高,表明AM 伴有局部或全身的Th2型免疫應(yīng)答系統(tǒng)活化[10]。子宮內(nèi)膜組織維持正常結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵在于內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性凋亡,AM 患者內(nèi)膜細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致子宮基底層防御功能及內(nèi)膜內(nèi)環(huán)境被破壞,內(nèi)膜組織穿透基底層侵入子宮肌層并發(fā)生失控性增長[11-12]。

Iso是一種廣泛存在于自然界中的天然甲基化黃酮類化合物,以往關(guān)于其的研究多集中在抗腫瘤、改善糖代謝等方面,而AM 以子宮內(nèi)膜向肌層浸潤性生長為主要病理表現(xiàn),增殖特性與惡性腫瘤具有相似性[13-15]。本研究結(jié)果顯示,Iso可提高AM 小鼠血清IFN-γ水平、子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率,降低IL-4水平、異位內(nèi)膜侵襲性評分,提示Iso可改善AM 免疫功能,促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡,并降低異位內(nèi)膜侵襲性。

p53是機(jī)體中重要的凋亡調(diào)節(jié)因子,突變型p53(P53-273H)在細(xì)胞周期中的作用與野生型p53 相反,其對細(xì)胞生長的抑制作用減弱,且對細(xì)胞過度增殖具有促進(jìn)作用[16-17]。EGFR 主要分布于上皮來源細(xì)胞的細(xì)胞膜表面,其高表達(dá)可降低細(xì)胞間的黏附性,促進(jìn)其移向細(xì)胞質(zhì)中,從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,引發(fā)侵襲、遷移等生物學(xué)行為。AM 子宮內(nèi)膜組織的上皮及腺體中均有EGFR 的表達(dá),且其表達(dá)量顯著高于在正常及子宮在位內(nèi)膜中的表達(dá)量[18]。AM 中突變型p53(P53-273H)的表達(dá)水平明顯升高,并通過上調(diào)EGFR促進(jìn)STAT3磷酸化,導(dǎo)致病灶細(xì)胞異常生長,形成異位內(nèi)膜[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AM 組P53-273H 蛋白表達(dá)量及p-EGFR/EGFR、p-STAT3/STAT3均高于對照組,經(jīng)Iso干預(yù)后有所降低,且表現(xiàn)為劑量依賴性,提示Iso對AM 的治療作用可能通過抑制p53/EGFR/STAT3信號通路來實(shí)現(xiàn)[20]。

綜上所述,Iso可降低AM 小鼠子宮異位內(nèi)膜侵襲性,促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡,推測其作用機(jī)制與抑制p53/EGFR/STAT3信號通路有關(guān)。