李 強(qiáng) ,王 剛 ,王 凡 ,李玉慶

1.唐山市協(xié)和醫(yī)院普外科,唐山 063000;2.唐山市協(xié)和醫(yī)院急診科,唐山 063000

橘紅素(tangeretin,Tan)是從枳實(shí)等中藥中提取的一種多氧甲基黃酮類成分,其對(duì)肺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞具有一定抑制作用[1]。Tan可能通過(guò)抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1(cyclinB1)的表達(dá)來(lái)抑制人胃癌AGS 細(xì)胞的增殖,還可通過(guò)p53依賴的線粒體途徑和Fas/FasL 介導(dǎo)的死亡受體途徑誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞的凋亡[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬與胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[5]。因此,本研究通過(guò)探究Tan對(duì)人胃癌AGS細(xì)胞自噬的作用機(jī)制,以期為T(mén)an用于胃癌的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7300型熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);IX53型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);JEM-1230型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

1.2 試藥

橘紅素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,上海研生實(shí)業(yè)有限公司);腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]激動(dòng)劑A-769662(美國(guó)Biovision 公司);HAM's/F12 培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司);Triol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;兔抗人AMPK單抗、p-AMPK 單抗、沉默調(diào)節(jié)蛋白(silent mating type information regulation 2 homolog-3,SIRT3)單抗、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ單抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司;p62 單抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;細(xì)胞自噬MDC染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞株

人胃癌AGS細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC(American Type Culture Collection)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將常規(guī)凍存復(fù)蘇的人胃癌AGS細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的HAM's/F12 培養(yǎng)液中,置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃恒溫培養(yǎng)。用質(zhì)量濃度0.25 g·mL-1胰蛋白酶消化傳代,2～3 d傳代1次,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞抑制率及細(xì)胞形態(tài)學(xué)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS 細(xì)胞,以1.0×106個(gè)·mL-1的密度接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,棄去培養(yǎng)基,加入含不同濃度的(5、10、30、60、120 μmol·L-1)Tan的培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h 后,于每孔中加入20 μL MTT(質(zhì)量濃度5 g·L-1)溶液,孵育4 h后,棄上清,加入150 μL DMSO 振 蕩10 min,用酶標(biāo) 儀檢測(cè)570 nm 處的吸光度。抑制率=[(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)]×100%。繪制細(xì)胞增殖抑制曲線,計(jì)算半抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50),表示抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)使所需的Tan濃度。觀察不同濃度Tan作用48 h后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.3 分組、干預(yù)及透射電鏡觀察細(xì)胞自噬

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1×107個(gè)·mL-1的密度接種于直徑90 mm 的培養(yǎng)皿,隨機(jī)分為激動(dòng)劑組、對(duì)照組、Tan組,待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基,以IC50的Tan 干預(yù)細(xì)胞(根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇濃度為60 μmol·L-1的Tan),激動(dòng)劑組加入60 μmol·L-1Tan+質(zhì)量濃度100 ng·mL-1A-769662的培養(yǎng)基,對(duì)照組加入常規(guī)培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 d,加入質(zhì)量濃度為0.25 g·mL-1的胰酶消化細(xì)胞,以1 200 r·min-1(離心半徑8 cm)離心10 min,收集細(xì)胞,加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液在4 ℃條件下固定3 d,置于體積分?jǐn)?shù)為1%的四氧化鋨中固定30 min,用醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色,置于電鏡下觀察細(xì)胞自噬情況。

2.4 MDC染色實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞自噬

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以1×106個(gè)·mL-1的密度接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,3個(gè)實(shí)驗(yàn)組按前述藥物干預(yù)方法處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用1×wash buffer洗滌2次,加入120 μL MDC 染液,室溫避光染色50 min,離心收集細(xì)胞,用1×wash buffer洗滌3次,滴加60 μL 抗淬滅封片液封片后置于4 ℃避光保存,置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬情況。

2.5 AMPK、SIRT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用Triol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟合成cDNA。qRT-PCR 反應(yīng)體系:反應(yīng)總體系20 μL,5×SYBR Green buffer 10 μL,5 μL cDNA 模板、引物(見(jiàn)表1)各1 μL(10 pmol·L-1),用雙蒸水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件:93 ℃預(yù)變性2 min,93 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸6 min。全部樣品設(shè)置3個(gè)平行管。以β-actin為內(nèi)參基因,用2-△△CT法計(jì)算AMPK、SIRT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence of gene

2.6 細(xì)胞AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1×106個(gè)·mL-1的密度接種于培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后,3個(gè)實(shí)驗(yàn)組按前述方法處理,并繼續(xù)培養(yǎng),48 h后收集細(xì)胞。加入裂解液后放置5 min,離心取上清,測(cè)蛋白濃度并統(tǒng)一上樣量,加入SDS上樣緩沖液,100 ℃水浴15 min,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜用1×TBST 沖洗3次,每次2 min,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 g·L-1的脫脂牛奶室溫封閉2 h,用1×TBST 洗膜2次,每次2 min,依次加入AMPK、SIRT3、LC3II、p62、β-actin 一抗(1∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜,用1×TBST 洗膜3次,每次5 min,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h。用1×TBST 洗膜3次,每次5 min,根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)滴加發(fā)光液,曝光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參β-actin的灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞抑制率

細(xì)胞24、48、72 h抑制率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48、72 h的抑制率均高于24 h(P＜0.05),各濃度Tan 48、72 h抑制率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制曲線,24、48、72 h AGS 細(xì)胞對(duì) 應(yīng)Tan 的IC50值分別 為(46.42±5.62)、(59.76±7.01)、(83.56±8.86)μmol·L-1。用60 μmol·L-1的Tan作用48 h,細(xì)胞的IC50值接近于50%,選取該濃度作用于細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度Tan的細(xì)胞抑制率比較 (n=5,)Tab.2 Inhibitory effect of different concentrations of Tan on AGS cells (n=5,)

表2 不同濃度Tan的細(xì)胞抑制率比較 (n=5,)Tab.2 Inhibitory effect of different concentrations of Tan on AGS cells (n=5,)

注:與0 μmol·L-1 比較,*P＜0.05;與5 μmol·L-1 比較,#P＜0.05;與10 μmol·L-1 比較,￥P＜0.05;與30 μmol·L-1比較,&P＜0.05;與60 μmol·L-1 比較,△P＜0.05;與24 h比較,▽P＜0.05。

3.2 不同濃度Tan作用48 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組細(xì)胞密度均勻,形態(tài)正常,生長(zhǎng)狀況良好,無(wú)壞死脫落;不同濃度Tan作用于細(xì)胞后,細(xì)胞密度隨著Tan濃度的增加而逐漸降低,細(xì)胞皺縮、變圓,脫落和死亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度Tan作用48 h后AGS細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 (MDC×200)Fig.1 Morphological changes of AGS cells after different concentrations of Tan for 48 hours (MDC×200)

3.3 電鏡觀察細(xì)胞自噬

Tan作用48 h后,AGS細(xì)胞的自噬情況見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),對(duì)照組AGS細(xì)胞可見(jiàn)少量自噬泡;Tan組細(xì)胞器清晰,無(wú)自噬泡;激動(dòng)劑組可見(jiàn)圓形、大小不一、包裹細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)的自噬泡。

圖2 透射電鏡觀察AGS細(xì)胞自噬 (×25 000)Fig.2 Observation of AGS cell autophagy under transmission electron microscope (×25 000)

3.4 MDC染色觀察細(xì)胞自噬

Tan作用48 h后的MDC 染色結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),對(duì)照組有熒光,Tan組與對(duì)照組比較,熒光強(qiáng)度較弱;激動(dòng)劑組與對(duì)照組比較,熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。

圖3 熒光顯微鏡下MDC染色觀察自噬小體 (×200)Fig.3 MDC staining under fluorescent microscope to observe autophagosomes (×200)

3.5 細(xì)胞中AMPK、SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)

細(xì)胞中SIRT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組比較,Tan組SIRT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量降低,激動(dòng)劑組SIRT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與Tan 組比較,激動(dòng)劑組SIRT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組細(xì)胞中AMPK mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中AMPK 和SIRT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較(,n=5)Tab.3 Comparison of gene expression levels of AMPK and SIRT3 in each group (,n=5)

表3 各組細(xì)胞中AMPK 和SIRT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較(,n=5)Tab.3 Comparison of gene expression levels of AMPK and SIRT3 in each group (,n=5)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與Tan組比較,bP＜0.05。

3.6 AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II和p62 蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)

細(xì)胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62 蛋白的相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組比較,Tan 組細(xì)胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低,p62蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,激動(dòng)劑組p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,p62蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05);與Tan 組比較,激動(dòng)劑組細(xì)胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,p62蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05)。各組細(xì)胞中AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Western blot detection of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II,p62 protein expression levels in cells of each group

表4 各組細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白表達(dá)水平比較 (,n=5)Tab.4 Comparison of protein expression levels of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II and p62 in cells of each group (,n=5)

表4 各組細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白表達(dá)水平比較 (,n=5)Tab.4 Comparison of protein expression levels of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II and p62 in cells of each group (,n=5)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與Tan組比較,bP＜0.05。

4 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的一種惡性腫瘤,可損害胃腸道、肝、腎的功能,目前臨床主要通過(guò)化療、手術(shù)、輔助性中藥和心理調(diào)試等手段進(jìn)行治療,但復(fù)發(fā)率高且預(yù)后極差,因此深入研究與胃癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制,尋找安全、有效的抗癌藥物十分迫切[6-7]。自噬是細(xì)胞的一種自我防御途徑,在某些應(yīng)激條件下,細(xì)胞的自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,Atg)會(huì)被激活,在這些基因的調(diào)控下利用溶酶體降解受損的大分子物質(zhì)和細(xì)胞器,為細(xì)胞本身提供營(yíng)養(yǎng)[8-9]。自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,有研究表明,自噬參與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程,在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。

Tan是一種天然多甲氧基黃酮類成分,主要存在于青皮、枳實(shí)、橘皮等中藥中,對(duì)于直腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用[11-12]。Tan可阻滯人卵巢癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并通過(guò)線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞系凋亡[13-14]。研究表明,Tan可增強(qiáng)5-氟尿嘧啶抑制人AGS胃癌細(xì)胞增殖的作用,同時(shí)還可抑制細(xì)胞發(fā)生自噬,造成自噬體的堆積,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。

本研究將不同濃度的Tan 作用于人胃癌AGS細(xì)胞后,隨著Tan濃度升高,細(xì)胞抑制率升高,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變程度加劇,表明Tan可抑制AGS細(xì)胞增殖;透射電鏡觀察顯示,Tan組無(wú)自噬泡;MDC 染色結(jié)果顯示,Tan組熒光強(qiáng)度最弱,提示Tan具有抑制AGS細(xì)胞自噬的作用。

自噬包括自噬體的形成,自噬體成熟后與溶酶體融合,形成自噬溶酶體,同時(shí)降解其內(nèi)容物,這是一個(gè)動(dòng)態(tài)且連續(xù)的過(guò)程[17]。通過(guò)自噬流可以評(píng)價(jià)自噬活性,自噬體的形成和消除是自噬流的2個(gè)十分緊密的過(guò)程。LC3蛋白是一種自噬標(biāo)志物,LC3的C 端能夠被Atg4分割成LC3I,存在于細(xì)胞質(zhì)中,形成自噬體以后,LC3I能夠與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3II。p62是一種選擇性自噬的底物蛋白,在自噬溶酶體的降解中發(fā)揮重要作用,當(dāng)缺少Atg基因或自噬體與溶酶體融合受阻時(shí),p62蛋白會(huì)明顯堆積,故可通過(guò)檢測(cè)p62蛋白的表達(dá)水平來(lái)觀測(cè)自噬流。本研究的結(jié)果顯示,經(jīng)Tan處理后LC3II和p62蛋白的表達(dá)水平降低,表明Tan具有抑制胃癌AGS細(xì)胞自噬的作用。AMPK/SIRT3信號(hào)通路正調(diào)控自噬相關(guān)途徑,某些分子通過(guò)刺激AMPK 的磷酸化提高SIRT3的表達(dá)水平而增強(qiáng)細(xì)胞自噬。研究表明,二甲雙胍可通過(guò)AMPK/SIRT3 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬[18]。Caffeine可通過(guò)調(diào)控SIRT3/AMPK 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而緩解細(xì)胞衰老[19]。本研究使用AMPK 激動(dòng)劑A-769662處理細(xì)胞,與對(duì)照組和Tan組比較,激動(dòng)劑組p-AMPK、SIRT3的表達(dá)水平顯著升高,表明AMPK/SIRT3 信號(hào)通路參與調(diào)控AGS細(xì)胞的自噬過(guò)程,Tan可能通過(guò)抑制AMPK/SIRT3信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生AGS自噬。

綜上所述,Tan具有抑制人胃癌AGS細(xì)胞發(fā)生自噬的作用,其可能是通過(guò)阻斷AMPK/SIRT3信號(hào)通路發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬的作用,從而發(fā)揮抗腫瘤作用,為臨床治療胃癌提供依據(jù)。