李 瑩 ,陳建玲 ,吳佩蔚 ,黃亞哲 ,張 帥 ,張 丹

1.南陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,南陽 473400;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)部,鄭州 450000

早孕期血栓前狀態(tài)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要原因之一,中醫(yī)將早孕期血栓前狀態(tài)所致的流產(chǎn)稱為早孕期血瘀流產(chǎn),目前臨床常用抗凝藥物,如阿司匹林、低分子肝素等進(jìn)行治療,有一定療效,但長(zhǎng)期使用這類藥物可能會(huì)引發(fā)過敏、血小板減少、出血等諸多不良反應(yīng)[1-3]。研究顯示,成功妊娠需要受精卵在母體子宮內(nèi)順利著床、分化及發(fā)育成熟,子宮內(nèi)膜容受性指母體子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力,與著床過程關(guān)系密切[4-5]。子宮動(dòng)脈血流阻力升高與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生關(guān)系密切,若子宮動(dòng)脈血流阻力增高,胎盤間血流灌注量減少,發(fā)生微循環(huán)障礙,將導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低,最終導(dǎo)致流產(chǎn)[6]。赤芍內(nèi)酯苷是毛茛科植物芍藥或川赤芍的主要藥效成分,具有活血通脈、抗血小板凝集作用[7]。本研究探究赤芍內(nèi)酯苷對(duì)早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)與容受性的影響,并分析機(jī)制,以期為臨床防治早孕期血瘀流產(chǎn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

小動(dòng)物SHINOVA 型西門子彩色多普勒超聲診斷儀(上海麥本醫(yī)療科技有限公司);OptimaTMXPN型超速離心機(jī)(貝克曼庫爾特生物科技有限公司)。

1.2 試藥

赤芍內(nèi)酯苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,規(guī)格20 mg,上海韻泰信息科技有限公司);兔抗鼠白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF),同源框基因A10(homebox A10 gene,HOXA10),黏蛋白1(mucin 1,MUC1),血管生成素-1(human angiopoietin 1,Ang-1),內(nèi)皮細(xì)胞TEK 酪氨酸激酶2(recombinant TEK Tyrosine kinase endothelial 2,Tie2),β-肌動(dòng)蛋 白(β-actin)多克隆抗體,山羊抗兔HRP 二抗,均購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

150只健康成年SPF級(jí)大鼠(8周齡),體質(zhì)量為180～240 g,平均(210±24) g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)[SCXK(京)2016-0008]。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

100只健康成年SPF級(jí)雌性大鼠、50只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,按照雌雄2∶1合籠交配,次日用無菌棉簽給雌鼠做陰道涂片并進(jìn)行鏡檢,發(fā)現(xiàn)有大量精子視為妊娠成功,為妊娠第1天,記錄體質(zhì)量。選取符合要求的50只孕鼠隨機(jī)分為5組,即對(duì)照組、模型組及赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組,每組10只。對(duì)照組不造模,其余4組均造模。

2.2 早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠模型建立

從妊娠第1天起,大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素0.9 mg·kg-1,每日1次,至妊娠第11天(對(duì)照組同時(shí)間皮下注射等量生理鹽水),并于妊娠第8天早上9:00開始(著床時(shí)間5～6 d)灌胃給予大鼠米非司酮溶液3.75 mg·kg-1·d-1(對(duì)照組同時(shí)間灌胃給予等量生理鹽水),同時(shí)于陰道內(nèi)置入棉球,次日取出棉球觀察棉球染血情況,若染血說明模型建立成功[8]。

2.3 給藥方式

赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組從大鼠妊娠第1天起,按照人與大鼠體表面積換算法計(jì)算赤芍內(nèi)酯苷臨床給藥劑量,按照臨床給藥劑量的2、4、8倍量,即50、100、200 mg·kg-1·d-1[9]給藥,下午5:00灌胃給藥,持續(xù)至妊娠第11天;模型組及對(duì)照組同時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃,期間動(dòng)物自由飲食、飲水,觀察大鼠一般情況。

2.4 子宮動(dòng)脈血流參數(shù)測(cè)定

各組大鼠于灌胃結(jié)束后,禁食24 h,腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,仰臥位,腹部備皮,用小動(dòng)物西門子彩色多普勒超聲診斷儀經(jīng)腹檢測(cè)子宮內(nèi)膜動(dòng)脈血流,檢測(cè)并計(jì)算孕鼠子宮內(nèi)膜動(dòng)脈血流參數(shù)血管阻力指數(shù)(resistance index,RI)、搏動(dòng)指數(shù)(pulsatility index,PI)。

2.5 標(biāo)本采集及解剖學(xué)觀察

子宮內(nèi)膜動(dòng)脈血流參數(shù)檢測(cè)完成后,于解剖臺(tái)上剖開大鼠腹腔,取出完整子宮組織,快速剝離周邊脂肪組織,用生理鹽水清洗干凈后,肉眼觀察子宮外觀形態(tài)、胚胎大小、完整性等,記錄胚胎著床點(diǎn)數(shù)、正常胚胎數(shù),計(jì)算流產(chǎn)數(shù)和流產(chǎn)率。將子宮組織保存于液氮中。流產(chǎn)數(shù)=著床點(diǎn)數(shù)-正常胚胎數(shù)。流產(chǎn)率=(流產(chǎn)數(shù)÷著床點(diǎn)數(shù))×100%。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

各組剝離胎盤后,取部分子宮組織,剪碎制備勻漿,加入RIPA 液置于冰上裂解,孵育20 min,以10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑均為8 cm),取上清,測(cè)定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻,沸水浴變性,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,以0.05 mg·mL-1脫脂奶粉封閉2 h,用TBST清洗,加入一抗LIF、Ang-1、Tie-2、β-actin,稀釋比均為1∶500,4 ℃孵育過夜,用TBST洗滌,加入山羊抗兔二抗(1∶1 000),37 ℃孵育1.5 h,顯影、定影,計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù),符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以()表示,多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

對(duì)照組大鼠自妊娠第1天至第11天,精神狀態(tài)良好,皮毛光亮,體質(zhì)量正常增長(zhǎng);模型組大鼠精神慵懶,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,于妊娠第8天給予米非司酮后部分大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì),陰道出血量較多,有妊娠物排出;赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠精神狀態(tài)不佳,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,陰道出血量較少,未見妊娠物排出,且上述變化呈劑量依賴性。

3.2 各組大鼠流產(chǎn)率比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠流產(chǎn)率升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠流產(chǎn)率降低(P＜0.05),呈劑量依賴性。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠的流產(chǎn)率比較 (,n=10)Tab.1 Comparison of abortion rate of rats in each group (,n=10)

表1 各組大鼠的流產(chǎn)率比較 (,n=10)Tab.1 Comparison of abortion rate of rats in each group (,n=10)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI水平均升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI水平均降低(P＜0.05),呈劑量依賴性。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 (,n=10)Tab.2 Comparison of endometrial hemodynamic parameters of rats in each group (,n=10)

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 (,n=10)Tab.2 Comparison of endometrial hemodynamic parameters of rats in each group (,n=10)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.4 子宮內(nèi)膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、HOXA10蛋白的表達(dá)水平降低,MUC-1蛋白的表達(dá)水平升高(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜LIF、HOXA10蛋白的表達(dá)水平升高,MUC-1蛋白的表達(dá)水平降低(P＜0.05),且呈劑量依賴性。結(jié)果見圖1、表3。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組大鼠子宮內(nèi)膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Western blot detection of protein expression of LIF,HOXA10 and MUC-1 in endometrial tissue of rats in each group

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達(dá)水平比較 (,n=10)Tab.3 Comparison of LIF,HOXA10 and MUC-1 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織LIF、HOXA10、MUC-1蛋白表達(dá)水平比較 (,n=10)Tab.3 Comparison of LIF,HOXA10 and MUC-1 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

3.5 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang、Tie-2 蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang、Tie-2蛋白的表達(dá)水平均降低(P＜0.05);與模型組比較,赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang、Tie-2蛋白的表達(dá)水平均升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性。結(jié)果見圖2、表4。

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Tie-2 蛋白表達(dá)水平比較 (,n=10)Tab.4 Comparison of Ang-1 and Tie-2 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Tie-2 蛋白表達(dá)水平比較 (,n=10)Tab.4 Comparison of Ang-1 and Tie-2 protein expression in endometrium of rats in each group (,n=10)

注:與對(duì)照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷低劑量組比較,cP＜0.05;與赤芍內(nèi)酯苷中劑量組比較,dP＜0.05。

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Western blot detection of the expression of Ang-1 and Tie-2 proteins in the endometrial tissue of rats in each group

4 討論

流產(chǎn)是指妊娠≤28周、胎兒體質(zhì)量＜1 kg而終止妊娠,其中自然流產(chǎn)是指自然狀態(tài)下發(fā)生的流產(chǎn),復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥3次的自然流產(chǎn),而中醫(yī)所說的早孕期血瘀流產(chǎn)是指早孕期血栓前狀態(tài)所致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[10-11],給育齡期女性身心健康及家庭幸福帶來嚴(yán)重影響。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,血瘀癥與機(jī)體血液流變學(xué)改變及微循環(huán)障礙有關(guān),其病因機(jī)制主要有寒邪、郁怒、氣虛及痰濕等[12]。赤芍內(nèi)酯苷是毛茛科植物芍藥或川赤芍干燥根的單萜苷類成分,現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明,其具有抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等藥理活性,具有散瘀止痛、抗血小板聚集的作用[13]。樂娜等[14]研究顯示,赤芍內(nèi)酯苷具有改善急性血瘀癥大鼠血液流變學(xué)及保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。賈敏等[15]研究顯示,赤芍內(nèi)酯苷對(duì)接受不同收縮刺激的大鼠腸系膜上動(dòng)脈血管有較強(qiáng)的舒張作用。研究顯示,子宮動(dòng)脈供血不足與自然流產(chǎn)關(guān)系密切,子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙、血流阻力增高使子宮和胎盤間血流灌注不足,最終導(dǎo)致流產(chǎn)[16]。血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI反映血流行進(jìn)時(shí)遇到的阻力大小,RI、PI值越高,說明血流阻力越大[17]。子宮內(nèi)膜是胚胎種植、吸取營(yíng)養(yǎng)進(jìn)而繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵組織,內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜胚胎順利著床的能力,對(duì)成功妊娠具有重要作用[18]。LIF是一種介導(dǎo)胚泡著床的主要細(xì)胞因子,與胚泡著床關(guān)系密切,是子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵標(biāo)志因子之一[19]。王原媛等[20]研究顯示,原發(fā)性不孕癥組患者子宮內(nèi)膜組織中LIF 蛋白表達(dá)缺失可能是導(dǎo)致不孕癥發(fā)病的關(guān)鍵因素。HOXA10是同源框基因家族成員之一,是子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能夠調(diào)控子宮內(nèi)膜增殖、分化及容受性的建立等過程,對(duì)胚胎種植及發(fā)育發(fā)揮重要作用[21]。MUC-1是抗黏附因子家族成員之一,研究證實(shí)其對(duì)胚胎的植入有阻礙作用,在子宮容受性建立過程中其水平下調(diào)有助于胚胎順利著床[22]。劉凱麗等[23]研究顯示,提高子宮腔內(nèi)HOXA10 的表達(dá)水平能夠增大子宮內(nèi)膜容受性,對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥起到一定治療作用。目前有關(guān)赤芍內(nèi)酯苷對(duì)早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)及子宮容受性影響的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠精神慵懶,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,于妊娠第8天給予米非司酮后部分大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì),陰道出血量較多,有妊娠物排出;而赤芍內(nèi)酯苷低、中、高劑量組大鼠精神狀態(tài)不佳,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,陰道出血量較少,未見妊娠物排出,且上述變化呈劑量依賴性。表明赤芍內(nèi)酯苷可能對(duì)大鼠血瘀流產(chǎn)具有一定防治作用。與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI及MUC-1 蛋白的表達(dá)水平均升高,子宮內(nèi)膜LIF、HOXA10蛋白的表達(dá)水平均降低。用赤芍內(nèi)酯苷干預(yù)后,大鼠子宮內(nèi)膜血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)RI、PI及MUC-1 蛋白的表達(dá)水平均降低,子宮內(nèi)膜LIF、HOXA10蛋白的表達(dá)水平均升高,且呈劑量依賴性,表明赤芍內(nèi)酯苷可能增加早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注阻力,降低血管床灌注阻力,改善子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)及容受性。

Ang-1是一種由周皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促血管生成因子,能夠與其特異性受體Tie-2受體結(jié)合形成Ang-1/Tie-2軸,參與新生血管生成進(jìn)而促進(jìn)血管成熟[24]。梁杰等[25]研究顯示,提高血清中Ang-1的質(zhì)量濃度及子宮組織中Tie-2 的表達(dá)水平能夠促進(jìn)不完全流產(chǎn)早孕大鼠子宮血管新生。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達(dá)水平均降低。經(jīng)赤芍內(nèi)酯苷干預(yù)后,大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-1、Tie-2蛋白的表達(dá)水平均呈劑量依賴性升高,表明赤芍內(nèi)酯苷能增加早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注阻力,降低血管床灌注阻力,改善子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)及容受性,可能與上調(diào)Ang-1、Tie-2蛋白的表達(dá)水平并促進(jìn)子宮內(nèi)膜微血管形成有關(guān)。

綜上所述,赤芍內(nèi)酯苷能夠改善早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流狀態(tài)及容受性,該作用可能是通過調(diào)控Ang/Tie-2 軸實(shí)現(xiàn)的。但本研究未能明確Ang/Tie-2軸在早孕期血瘀流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜血流灌注阻力減少及容受性降低中的具體調(diào)控機(jī)制,后期應(yīng)深入研究。