王晨宇,李興旺,張軍杰,姚坤厚,華 龍,胡軍紅

河南大學淮河醫(yī)院普通外科,開封 475000

結(jié)直腸癌為常見的腹部惡性腫瘤之一,化療是治療結(jié)直腸癌的重要輔助手段,可有效降低結(jié)直腸癌的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率[1]。但目前所用的化療藥物普遍存在多藥耐藥性、高不良反應等缺陷,腫瘤獲得化學耐藥性風險較高,是治療癌癥的重大障礙[2]。粉防己堿(tetrandrine,Tet)是一種天然生物堿,在關(guān)節(jié)炎、矽肺等疾病的治療中發(fā)揮重要作用[3]。KUMAR A等[4]研究表明,Tet具有多重耐藥逆轉(zhuǎn)活性。長鏈非編碼RNA(LncRNA)FEZF1-AS1 是人類癌癥形成的關(guān)鍵調(diào)控因子,李宗鑫等[5]研究發(fā)現(xiàn),其在結(jié)腸癌中表達上調(diào),并通過多種潛在機制調(diào)控細胞的生物學行為。奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)為治療結(jié)直腸癌的常用化療藥物。本研究通過建立人結(jié)直腸癌耐LOHP細胞株,并干擾FEZF1-AS1的表達,分析Tet對結(jié)直腸癌細胞化療耐藥的作用及機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LSRFortsa X-20 型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司);CFX Connect型熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

Tet(質(zhì)量分數(shù)≥98%,上海依赫生物科技有限公司);奧沙利鉑(規(guī)格50 mg,國藥準字H20093487,浙江海正藥業(yè)股份有限公司);qPCR 試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司);cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司);兔抗人三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白亞家族C 成員1(adenosine triphosphate binding cassette subfamily C member 1,ABCC1),多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1),P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),GAPDH 抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗,均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;Annexin V/PI染色試劑盒(江蘇凱基科技生物發(fā)展有限公司)。

1.3 細胞株

人結(jié)直腸癌敏感細胞株HCT116購自南京凱基科技生物發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 HCT116/L-OHP細胞培養(yǎng)

取人結(jié)直腸癌敏感細胞株HCT116接種于含有50 mL·L-1胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HCT116 細胞,將細胞密度調(diào)節(jié)為1×105個·mL-1,加入L-OHP培養(yǎng)液作用48 h,棄上清,加入無L-OHP 的新鮮培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)。待細胞恢復正常生長后,消化傳代,再用L-OHP培養(yǎng)液作用48 h。如此反復換液、傳代,逐漸提高L-OHP的質(zhì)量濃度(1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、9.6、19.52 μg·mL-1),最終獲得對L-OHP 耐藥的HCT116細胞,將其命名為HCT116/L-OHP細胞。

2.2 MTT 法檢測不同質(zhì)量濃度Tet對L-OHP 細胞活力的影響

將Tet倍比稀釋到質(zhì)量濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg·mL-1,每孔加入200 μL 相應含藥培養(yǎng)基,將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,取出后進行MTT 染色,測定490 nm處的吸光度A值,計算抑制率。抑制率=[(1-實驗組A值/對照組A值)]×100%。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染與實驗分組

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使HCT116/L-OHP 細胞轉(zhuǎn)染FEZF1-AS1,設(shè)為FEZF1-AS1 組。將正常培養(yǎng)的HCT116/L-OHP細胞作為空白組。將無毒劑量的Tet作用于HCT116/L-OHP細胞48 h作為Tet 組。將Tet 作用于轉(zhuǎn)染了FEZF1-AS1的HCT116/L-OHP細胞,作為FEZF1-AS1+Tet組。4組細胞均轉(zhuǎn)染48 h,用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效果,隨后進行后續(xù)研究。

2.4 MTT 法檢測各組細胞的增殖活性

取各組細胞按2×103個/孔接種于96孔板,在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時每孔加MTT 溶液20 μL(質(zhì)量濃度5 mg·mL-1),培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加150 μL DMSO,孵育2 h,用酶標儀測定490 nm 處的吸光度值A(chǔ)。獨立重復測量3次,取均值。

2.5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率

轉(zhuǎn)染48 h后,用胰酶消化,離心收集各組細胞,用PBS洗滌,加入結(jié)合緩沖液重懸細胞,使其密度達到1×106個·mL-1。吸取100 μL 細胞懸液加入流式管,加入Annexin V-FITC 5 μL 和PI 5 μL,混勻后室溫避光孵育15 min。每管加結(jié)合緩沖液400 μL,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 qRT-PCR 檢測各組細胞ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達水平

用Trizol法提取各組細胞RNA,測定總RNA濃度,按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA,稀釋5倍后進行PCR 檢測。反應體系:10×Taq緩沖度5 μL,MgC124 μL,dNTPs 1 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA 聚合酶0.5 μL,加滅菌雙蒸水至總體積為50 μL。PCR 程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,75 ℃延伸45 s,共43個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。上述產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

2.7 Western blot檢測各組細胞中ABCC1、MDR1和P-gp蛋白的表達水平

用胰酶消化細胞,冰上裂解細胞0.5 h,用BCA法檢測各組細胞蛋白濃度,取20 μL樣本置于沸水浴中5 min變性,配制質(zhì)量濃度為100 g·L-1的SDSPAGE 凝膠,加樣后電泳,將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶中室溫封閉1 h,洗膜后將膜置于含有ABCC1、MDR1、P-gp和GAPDH 抗體(1∶1 000)的平皿內(nèi),于4 ℃搖床中孵育過夜,次日取出洗膜。用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000),將PVDF膜置入其中,孵育2 h,洗膜。在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液,用多功能成像儀觀察蛋白的表達情況。

2.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 26.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù),HCT116/LOHP細胞凋亡率及ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 和蛋白的表達水平等計量資料均符合正態(tài)分布,計量資料以()表示,多組比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Tet對HCT116/L-OHP細胞增殖抑制率的影響

隨著Tet倍比稀釋質(zhì)量濃度的下降,細胞增值抑制率隨之下降。選用抑制率為5%時Tet的質(zhì)量濃度(0.45 μg·mL-1)作為無毒劑量。結(jié)果見表2。

表2 Tet對HCT116/L-OHP細胞增殖抑制率的影響Tab.2 Inhibition rate of Tet on the proliferation of HCT116/L-OHP cells

3.2 Tet對HCT116/L-OHP細胞增殖活性的影響

各組24、48、72 h的HCT116/L-OHP細胞A490值隨時間延長而升高,且呈時間依賴性(P＜0.05)。與空白組比較,FEZF1-AS1組A490值升高,FEZF1-AS1+Tet組、Tet組A490值降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet 組、Tet 組A490值降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組A490值降低(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組HCT116/L-OHP細胞增殖活性比較 (n=3,)Tab.3 Comparison of proliferation activity of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表3 各組HCT116/L-OHP細胞增殖活性比較 (n=3,)Tab.3 Comparison of proliferation activity of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05;與24 h比較,&P＜0.05;與48 h比較,▲P＜0.05。

3.3 Tet對HCT116/L-OHP細胞凋亡的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組細胞凋亡率降低,FEZF1-AS1+Tet 組、Tet 組細胞 凋亡率升高(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet 組細胞 凋亡率升高(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組細胞凋亡率升高(P＜0.05)。結(jié)果見表4、圖1。

圖1 各組HCT116/L-OHP細胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group

表4 各組HCT116/L-OHP細胞凋亡率比較 (n=3,)Tab.4 Comparison of apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表4 各組HCT116/L-OHP細胞凋亡率比較 (n=3,)Tab.4 Comparison of apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

3.4 Tet對細胞中ABCC1、MDR1和P-gp mRNA表達水平的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達水平升高,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達水平降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA的表達水平降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達水平下降(P＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組HCT116/L-OHP細胞中ABCC1、MDR1、P-gp mRNA表達水平的比較 (n=3,)Tab.5 Comparison of mRNA expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表5 各組HCT116/L-OHP細胞中ABCC1、MDR1、P-gp mRNA表達水平的比較 (n=3,)Tab.5 Comparison of mRNA expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

3.5 Tet對各組細胞中ABCC1、MDR1 和P-gp表達水平的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組ABCC1、MDR1、P-gp表達水平升高,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp表達水平下降(P＜0.05);與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp表達水平下降(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組ABCC1、MDR1、Pgp表達水平下降(P＜0.05)。結(jié)果見表6、圖2。

圖2 Western blot檢測各組HCT116/L-OHP細胞中ABCC1、MDR1、P-gp蛋白的表達水平Fig.2 Western blot detection of protein expression levels of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group

表6 各組HCT116/L-OHP細胞中ABCC1、MDR1、P-gp表達水平的比較 (n=3,)Tab.6 Comparison of expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表6 各組HCT116/L-OHP細胞中ABCC1、MDR1、P-gp表達水平的比較 (n=3,)Tab.6 Comparison of expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

4 討論

結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)的腫瘤,化療耐藥是目前影響患者長期生存的主要障礙之一[6]?；熌退幨侵改[瘤細胞對化療藥物的作用產(chǎn)生耐藥性,從而使化療藥效降低,化療耐藥不能通過增大藥物用量解決[7]?；熌退幨墙Y(jié)直腸癌治療失敗的主要因素,尋找低毒、高效的化療增敏劑十分必要。Tet是提取自傳統(tǒng)中藥粉防己中的雙芐基異喹啉生物堿,為粉防己的主要藥效成分,在癌癥治療中有一定效果[8]。LIN W C等[9]研究發(fā)現(xiàn),Tet對化療有增敏的作用。腫瘤耐藥細胞增殖活性抑制、誘導凋亡是逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞化療耐藥的主要途徑。HORNG C T 等[10]的研究表明Tet可降低癌細胞的增殖速度,XU H 等[11]報道Tet可誘導多種癌細胞凋亡。本實驗用無毒劑量的Tet作用于HCT116/L-OHP 細胞,結(jié)果顯示,與空白組比較,Tet組HCT116/L-OHP細胞的增殖活性明顯降低、凋亡率明顯升高,提示Tet可抑制HCT116/L-OHP細胞的增殖活性,并誘導其發(fā)生凋亡,與既往的研究結(jié)果一致。BIAN Z 等[12]通過lncRNA 微陣列確定了FEZF1-AS1是一種在結(jié)直腸癌中高度過量表達的lncRNA。ZHOU Y 等[13]報道FEZF1-AS1可通過多種潛在機制調(diào)節(jié)細胞增殖,并發(fā)揮抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本研究中,與空白組比較,FEZF1-AS1組HCT116/L-OHP細胞的增殖活性較高、凋亡率較低,提示過表達FEZF1-AS1可提高HCT116/L-OHP細胞的增殖活性,并降低凋亡率;與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet組HCT116/L-OHP細胞增殖活性下降、凋亡率升高,提示Tet 可能通過下調(diào)FEZF1-AS1逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細胞的化療耐藥。

Tet可通過多靶點、多途徑提高腫瘤細胞化療耐藥性,FEZF1-AS1可能是其靶點之一,而化療耐藥機制復雜,耐藥基因的參與也是腫瘤化療耐藥發(fā)生的主要因素,Tet 亦可能通過調(diào)控耐藥基因?qū)崿F(xiàn)化療增敏[14]。ABCC1、MDR1基因均為近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤耐藥相關(guān)基因,由其編碼的耐藥蛋白可通過核靶點屏障機制,參與由細胞質(zhì)囊泡運輸介導的耐藥過程[15]。ABC是負責細胞膜間物質(zhì)轉(zhuǎn)運的蛋白,參與腫瘤耐藥過程,ABCC1為ABC家族的重要成員,在腫瘤細胞耐藥中亦扮演重要角色[16]。MDR1是人類腫瘤多藥耐藥基因家族主要成員之一,其表達與腫瘤耐藥的發(fā)生有關(guān)。MDR1是能量依賴跨膜外排泵,可減少細胞內(nèi)藥物蓄積,導致細胞對藥物產(chǎn)生耐受[17]。P-gp作為MDR1的表達產(chǎn)物,是最常見的耐藥蛋白,功能與MDR1相似,即將腫瘤細胞內(nèi)的藥物主動泵出,從而降低細胞內(nèi)化療藥物的有效質(zhì)量濃度,使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性[18-19]。DONG J等[20]研究發(fā)現(xiàn),P-gp過表達會促進某些抗癌藥物從腫瘤細胞內(nèi)流出,從而導致多藥耐藥,故認為抑制P-gp可能是克服癌癥多藥耐藥的策略之一。本研究的結(jié)果顯示,與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet 組細胞內(nèi)ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 與蛋白的表達水平逐漸降低,提示Tet 可能通過下調(diào)FEZF1-AS1,并下調(diào)ABCC1、MDR1、P-gp的表達水平發(fā)揮逆轉(zhuǎn)細胞化療耐藥的作用。

綜上所述,Tet可逆轉(zhuǎn)HCT116/L-OHP細胞對L-OHP的耐藥,機制可能與下調(diào)FEZF1-AS1 并抑制ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 和蛋白的表達有關(guān)。