張 釗 ,閆武超 ,武星旭 ,王彩龍 ,趙 陽(yáng)

1.張家口市第四醫(yī)院藥劑科,張家口 075000;2.張家口市第四醫(yī)院功能科,張家口 075000

女珍顆粒是由女貞子、墨旱蓮、地黃、紫草等10味藥材經(jīng)研細(xì)、煎煮、濃縮、制粒等工藝制成的中藥顆粒劑。更年期綜合征又稱圍絕經(jīng)期綜合征,是指婦女絕經(jīng)前、后所表現(xiàn)出來(lái)的一系列臨床綜合癥狀[1]。女珍顆粒具有滋腎、寧心的藥效,臨床主要用于更年期綜合征屬肝腎陰虛、心肝火旺證者的治療,能夠改善患者烘熱汗出、五心煩熱、心悸、失眠等癥狀[2]。10味藥材中,女貞子有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)等功效[3-5];墨旱蓮有滋補(bǔ)肝腎、涼血止血等功效[6-8];紫草有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑等功效[9-11]。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快,女珍顆粒在臨床應(yīng)用越發(fā)廣泛,因此加強(qiáng)對(duì)女珍顆粒的質(zhì)量控制,可有效保障老齡婦女的用藥安全。女珍顆?，F(xiàn)收載于2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)一部[12],其中含量測(cè)定項(xiàng)僅針對(duì)女貞子藥材,即僅測(cè)定特女貞苷的含量,項(xiàng)目單一,不能全面地反映該產(chǎn)品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)研究女珍顆粒的藥材組成,針對(duì)女貞子、旱墨蓮和紫草3種主要藥材[13-20],建立測(cè)定女珍顆粒中特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的波長(zhǎng)切換-超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型主機(jī),2998型DAD檢測(cè)器,包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、EMPOWER色譜工作站(美國(guó)沃特世科技有限公司);KQ-300GVDA 型超聲儀(昆山舒美超聲儀器有限公司);Agilent Eclipe SB C18液相色譜柱(美國(guó)Agilent 科技有限公司);Mettler-Toled AE200型電子天平(萬(wàn)分之一,梅特勒-托利多公司);Milli-q Academic型超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試藥

特女貞苷(批號(hào)111926-201906,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.0%);蟛蜞菊內(nèi)酯(批號(hào)111885-202105,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.2%);β,β′-二甲基 丙烯酰 阿卡寧(批 號(hào)111689-201805,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;女珍顆粒(規(guī)格:6 ·袋-1,批號(hào):20210225、20210613、20210842,山東鳳凰制藥股份有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)FLUKA 公司);冰醋酸(優(yōu)級(jí)純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司);超純水(自制);其他試劑均為分析純,均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipe SB C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm(特女貞苷)、352 nm(蟛蜞菊內(nèi)酯)、276 nm(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧);進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:5 mL·L-1冰醋酸溶液(A),-乙腈(B);梯度洗脫,洗脫程序:0～5 min,4% B,5～11 min,4%～47% B,11～23 min,47%～91% B,23～28 min,91% B,28～28.5 min,91%～4% B,28.5～33 min,4% B。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 取特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品,加甲醇分別制成每1 mL溶液中含特女貞苷475 μg、蟛蜞菊內(nèi)酯97.2 μg、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧196 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液,搖勻。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取2.2.1項(xiàng)下特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別精密吸取1.0 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,得特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧質(zhì)量濃度分別為47.5、9.72、19.6 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取女珍顆粒供試品,研細(xì),精密稱取0.5 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇約35 mL,超聲處理20 min后取出(超聲功率為200 W,超聲頻率為70 kHz),放冷至室溫,加甲醇定容,混勻,用0.22 μm 濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液 按女珍顆粒藥材比例和制備方法,分別制備不含女貞子、墨旱蓮和紫草的陰性供試品,陰性供試品按供試品溶液制備方法進(jìn)行配制。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖。結(jié)果顯示,陰性供試品溶液在特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾峰出現(xiàn),且3種指標(biāo)成分理論塔板數(shù)、分離度等符合2020 年版《中國(guó)藥典》中的要求。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 典型HPLC圖Fig.1 Typical HPLC chromatogram

2.3.2 線性關(guān)系考察 取2.2.1項(xiàng)下特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,分別精密量取適量,加甲醇制備含特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧系列曲線溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 曲線方程、相關(guān)系數(shù)及范圍Tab.1 Linear curve equations,correlation coefficients and concentration ranges

2.3.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 取已知特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的女珍顆粒(規(guī)格:6 g·袋-1,批號(hào)20210225),研細(xì),精密稱取約0.5 g,置于50 mL量瓶中,共稱取6份平行樣品。分別加入2.2.1 項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量,后續(xù)按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,得6份加標(biāo)測(cè)試溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖,計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of standard addition recovery test

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,收集色譜圖。根據(jù)特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。計(jì)算得特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧精密度的RSD 值分別為0.71%、0.52%、1.01%,表明儀器的精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取女珍顆粒(規(guī)格:6 g·袋-1,批號(hào)20210225),研細(xì),精密稱取0.5 g,共稱取6份平行樣品,后續(xù)按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,得6份重復(fù)性檢查溶液,按2.1 項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖。根據(jù)特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧檢測(cè)結(jié)果計(jì)算RSD 值。計(jì)算得特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧重復(fù)性的RSD 分別為1.2%、0.91%、1.3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取女珍顆粒(規(guī)格:6 g·袋-1,批號(hào)20210225),按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,制備供試品溶液;于室溫下放置0、3、6、9、15、24 h后,按2.1項(xiàng)下色譜條件,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖。根據(jù)特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積計(jì)算RSD 值。計(jì)算得特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD 值分別為1.2%、1.3%、1.5%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 市售供試品的檢測(cè)

取女珍顆粒(規(guī)格:6 g·袋-1,批號(hào):20210225、20210613、20210842,生產(chǎn)廠家山東鳳凰制藥股份有限公司),按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,制備供試品溶液,每個(gè)樣品制備2份平行樣品;再按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣10 μL,收集色譜圖。計(jì)算3批樣品中特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試品含量檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of content determination of samples

3 討論

3.1 流動(dòng)相體系的選擇

液相色譜法常用的流動(dòng)相有甲醇體系和乙腈體系,實(shí)驗(yàn)分別考察將甲醇-水、乙腈-水、5 mL·L-1醋酸溶液-甲醇和5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí),特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧3種目標(biāo)物的出峰時(shí)間、分離效果等。結(jié)果顯示,選擇甲醇-水體系時(shí),3種目標(biāo)物的出峰時(shí)間較長(zhǎng),檢測(cè)效率偏低;選擇乙腈-水體系時(shí),蟛蜞菊內(nèi)酯色譜峰發(fā)生分叉,定量結(jié)果不準(zhǔn)確;選擇5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈體系時(shí),3種指標(biāo)成分分離良好,出峰時(shí)間較短,且無(wú)基質(zhì)干擾。因此,實(shí)驗(yàn)選擇5 mL·L-1醋酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取2.2.1項(xiàng)下特女貞苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,加甲醇稀釋制成每1 mL 溶液中含有特女貞苷47.5 μg的溶液。取該溶液,設(shè)置液相色譜二極管陣列檢測(cè)器掃描范圍為200～400 nm,得特女貞苷最大吸收波長(zhǎng)為225 nm;同法得蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的最大吸收波長(zhǎng)分別為352、276 nm。由于3種目標(biāo)物波長(zhǎng)分布較廣,無(wú)法采用單一檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量檢測(cè),故實(shí)驗(yàn)選用波長(zhǎng)切換法,即分別在3個(gè)波長(zhǎng)下,對(duì)3種待測(cè)物進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 典型光譜圖Fig.2 Typical UV spectra

3.3 提取條件的優(yōu)化

女珍顆粒供試品基質(zhì)復(fù)雜,由10味藥材組成,因此選擇合適的提取條件對(duì)提高檢測(cè)靈敏度、降低基質(zhì)干擾等具有關(guān)鍵的作用。實(shí)驗(yàn)分別考察選擇體積分?jǐn)?shù)80%、85%、90%、95%的甲醇和甲醇對(duì)女珍顆粒供試品中特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的提取效果,結(jié)果顯示選擇甲醇時(shí)提取效果最佳。確定提取溶劑后,分別考察超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)提取效果的的影響,最終確定最佳的提取條件為將甲醇作為提取溶劑,超聲功率為200 W,時(shí)間為20 min。

綜上所述,實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定女珍顆粒中特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的波長(zhǎng)切換-超高效液相色譜法,對(duì)該方法的重復(fù)性、線性、回收率等進(jìn)行了考察,并對(duì)前處理的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn),可用于女珍顆粒中成藥的質(zhì)量控制,為《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的提高提供技術(shù)參考。