王旭芳 ,魏敬東 ,劉 倫 ,張欣蕾 ,林嗣松 ,李 捷 ,王四旺*

1.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部,西安 710069;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥與天然藥物學(xué)教研室,西安 710032;3.西安頌天樂濟(jì)生物科技有限公司,西安 710032

糖尿病在中醫(yī)學(xué)中稱為消渴病,臨床上以高血糖為主要特點(diǎn),其主要表現(xiàn)為“三多一少”癥狀,即多尿、多食、多飲、消瘦。中醫(yī)認(rèn)為,消渴病主要是由于燥熱偏盛、陰津虧耗所致。中醫(yī)關(guān)于消渴病的治則是滋陰清熱、益氣養(yǎng)陰[1]。

消糖膠囊是由本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合糖尿病中醫(yī)臨床治療制成的中成藥,由玄參、知母、黃芩、葛根、地骨皮、虎杖等多味中藥組成,其主要功效是滋陰補(bǔ)氣、清肺養(yǎng)胃、降糖降脂,主治2型糖尿病。處方中的君藥主要活性成分為鹽酸小檗堿,能夠刺激AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK),減輕體質(zhì)量,改善葡萄糖耐量[2-3]。虎杖及其活性成分虎杖苷具有改善微循環(huán)、抗氧化、降血脂等藥理作用,對糖尿病血管損傷具有一定的緩解作用[4-5]。葛根具有生津止渴、升陽止瀉的功效,用于口渴、消渴等證的治療,其主要活性物質(zhì)為葛根素[6-7]。

為更好地控制消糖膠囊的質(zhì)量,開展后續(xù)藥學(xué)和臨床研究,保證臨床的安全使用,本實(shí)驗(yàn)對消糖膠囊中的主要成分鹽酸小檗堿[8-10]、虎杖苷[11-12]和葛根素[13-15]進(jìn)行含量測定,為消糖膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A HT 型高效液相色譜儀(日本島津公司);四元梯度泵(美國Bio-Rad公司);在線真空脫氣機(jī)(美國Eppendorf公司);Sartorius ME235S型電子分析天平(德國Sartorius公司);超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);SK250-LHC型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);電子恒溫水浴鍋(北京化玻醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試藥

甲醇和乙腈[色譜級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司];磷酸(天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

對照品:虎杖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號19062702,成都曼斯特生物科技有限公司);鹽酸小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號110713-200609)和葛根素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號752-200108),均購自中國食品藥品檢定研究院;消糖膠囊由本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

消糖膠囊內(nèi)容物為棕褐色粉末或顆粒,氣微香,味酸、微苦。

2.2 制劑中葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:乙腈(A)-1mL·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脫:0～20 min,17%～22% A;20～32 min,22%～26% A。流速:1.0 mL·min-1。柱溫:30 ℃。檢測波長:306 nm。進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取消糖膠囊內(nèi)容物粉末30 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,精密稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥12 h的葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿對照品適量,加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為0.12、2.50、6.01 mg·mL-1的葛根素、虎杖苷、鹽酸小檗堿對照品溶液。精密吸取各對照品溶液1 mL,置于5 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取上述混合對照品溶液和供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測,結(jié)果見圖1。葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的出峰時(shí)間分別為8.198、20.092、31.716 min,表明供試品中其他組分不干擾葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的測定,并且待測成分與其他峰的分離度良好,溶劑對待檢測物質(zhì)無干擾[16]。

2.2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密稱取處方中除葛根外的其他藥材,按制劑工藝制備缺葛根的陰性制劑,取該制劑30 mg,按照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備缺葛根的陰性供試品溶液。同法分別制備缺虎杖和缺鹽酸小檗堿的陰性制劑,再按照供試品溶液制備方法制備缺虎杖和缺鹽酸小檗堿的陰性供試品溶液。分別精密吸取各陰性供試品溶液10 μL 注入液相色譜儀,進(jìn)行測定,結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示,陰性樣品的色譜圖中在與對照品相同保留時(shí)間位置上無吸收峰,表明該方法的專屬性好、靈敏度高[17]。

圖1 消糖膠囊HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of Xiaotang Capsules

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.3項(xiàng)下的混合對照品溶液1 mL,置于10 mL 量瓶中,再以此法逐級稀釋成6個(gè)系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,分別按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,表明線性關(guān)系良好。

表1 葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of puerarin,polydatin and berberine hydrochloride

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下的混合對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別檢測葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的峰面積,計(jì)算RSD 值。計(jì)算得葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD 值分別為0.53%、1.74%、1.35%,表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液10 μL,分別于0、2、4、6、8 h注入液相色譜儀檢測,記錄峰面積,計(jì)算RSD 值。葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD 值分別為1.26%、1.31%、1.41%(n=6),表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定消糖膠囊內(nèi)容物粉末6份,按照2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測。計(jì)算3種成分的平均含量和RSD 值。計(jì)算得葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD值分別為0.80%、1.00%、1.71%(n=6),表明該樣品制備方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。

2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定消糖膠囊內(nèi)容物粉末6份,每份15 mg,按各成分在樣品中的含量與相應(yīng)對照品為1∶1的比例,精密加入各對照品,按照2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法,制成供試品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算各成分的平均回收率及RSD 值。結(jié)果見表2。計(jì)算得葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的平均回收率分別為97.76%、99.89%、105.33%,RSD 值分別為0.93%、2.01%、2.06%(n=6),表明該方法的回收率良好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

2.2.11 樣品含量測定 精密稱定3個(gè)批次的消糖膠囊樣品,每個(gè)樣品取3份,按照2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備樣品,按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測,記錄3種成分的峰面積,計(jì)算消糖膠囊供試品中葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表3。計(jì)算得樣品中葛根素、虎杖苷、鹽酸小檗堿的平均含量分別為0.127 7、0.151 6、42.434 5 mg·粒-1(每粒按0.4 g計(jì)算)。

表3 消糖膠囊中葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of puerarin,polydatin and berberine hydrochloride in Xiaotang Capsules

3 討論

3.1 提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中用不同溶劑(水、甲醇、乙醇)和不同提取方法(超聲、加熱回流)對樣品進(jìn)行處理,結(jié)果顯示,以甲醇為提取溶劑超聲提取時(shí),各色譜峰分離度較好,故選擇甲醇超聲作為供試品溶液的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)用DAD 檢測器對鹽酸小檗堿、葛根素和虎杖苷在190～800 nm 處進(jìn)行全波長掃描[18-20],結(jié)果顯示,鹽酸小檗堿λmax=237、266、349 nm,葛根素λmax=242、306nm,虎杖苷λmax=218、309 nm,通過考察不同檢測波長下的色譜峰豐度和分離度,發(fā)現(xiàn)3種成分在306nm 處基線平穩(wěn),色譜豐度好,且無雜質(zhì)干擾,故選擇以306 nm 作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中用不同的流動相(乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-0.5mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-1mL·L-1醋酸水溶液)進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果顯示,以乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液梯度洗脫時(shí),分離效果更好,且峰形較好,故選擇其作為流動相。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了測定消糖膠囊制劑中葛根素、虎杖苷和鹽酸小檗堿3種成分的HPLC 法。該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、可行性強(qiáng),能夠用于消糖膠囊的質(zhì)量控制。