李 建,黃宇思,賴 慧,陳 立,楊 雪,趙福蘭

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,瀘州 646000

大葉茜草為茜草科植物大葉茜草(RubiaschumannianaPritz.)的干燥根莖,春、秋采挖,除去泥沙,干燥,即得;具有涼血止血、化瘀止血、消炎解毒的作用;臨床主要用于治療血熱引起的各種崩漏出血、吐血、便血以及腫瘤、跌打損傷腫痛等[1-3]。鑒定大葉茜草的標(biāo)準(zhǔn)目前收錄于《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版,標(biāo)準(zhǔn)中只有大葉茜草的常規(guī)檢查項和對大葉茜草素的含量控制[4],無其他質(zhì)控指標(biāo)(如針對大葉茜草中蒽醌類、環(huán)肽類化學(xué)成分的檢測指標(biāo)和其中多種微量元素的檢測指標(biāo))[5-7]。近年來由于人們對中草藥的深入研究,發(fā)現(xiàn)微量元素與人體的新陳代謝、生長發(fā)育和疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián),因此有必要對大葉茜草中的微量元素進(jìn)行含量測定。目前關(guān)于大葉茜草的報道主要是針對大葉茜草的化學(xué)成分[8-9]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10]、藥理作用的研究[11-12],以及微量元素含量測定的報道。目前用于中藥材中微量元素測定的方法主要有原子吸收光譜法[13-14]、原子熒光光譜法[15-16]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy,ICP-OES[17])法、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS[18])法等。原子吸收光譜法和原子熒光光譜法只能測定單一元素的含量,不能同時測定多種元素的含量,且靈敏度低、耗時較長。等離子體發(fā)射光譜和等離子質(zhì)譜法在測定痕量元素中具有較大優(yōu)勢,可以同時測定多種元素,測定速度快、靈敏度高,目前電感耦合等離子體質(zhì)譜法是公認(rèn)的可同時測定多種元素較常用的方法,因此廣泛用于食品、藥品、紡織、農(nóng)產(chǎn)品等各個行業(yè)。因此,本文參考文獻(xiàn)方法[19-20]建立同時測定不同產(chǎn)地16批次大葉茜草中9 種微量元素含量的ICP-MS法,并用聚類分析(cluster analysis,CA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)對測定結(jié)果進(jìn)行全面評價,篩選出大葉茜草的主要特征元素,并揭示不同產(chǎn)地大葉茜草之間的差異,從而客觀、全面地評價大葉茜草的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nexlon 310X 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國PE公司);Muiti Wav PRO 41HVT56型微波消解儀(美國安東帕儀器公司);Sartorius BP210S型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);100、200 μL,1 mL移液槍均購自德國Eppendorf公司。

1.2 試藥

多元素對照品溶液[(鋁(Al)、砷(As)、硼(B)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鉀(K)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(Mo)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、銻(Sb)、硒(Se)、錫(Sn)、鍶(Sr)、鈦(Ti)、鉈(Tl)、釩(V)、鋅(Zn),批號GNM-M251678-2015,質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1],內(nèi)標(biāo)溶液鍺(Ge)、銦(In)(質(zhì)量濃度均為1 000 μg·mL-1),均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心;KED調(diào)諧液(儀器自帶,美國珀金埃爾默公司);硝酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%,優(yōu)級純,購自美國Merck公司);水為超純水,電阻率≥18.3 MΩ·cm,用Millipore超純水機制備。

16批大葉茜草于2019～2021年在各大藥材市場和超市購買,均經(jīng)趙福蘭主任藥師鑒定為茜草科植物大葉茜草(RubiaschumannianaPritz.)的干燥根莖,為大葉茜草正品。藥材來源信息見表1。

表1 大葉茜草的來源信息Tab.1 Sources of Rubia schumanniana Pritz.

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

ICP-MS儀器的工作參數(shù):RF射頻功率為1 500 W,等離子體氣體流速為20 L·min-1,輔助氣體流速為1.6 L·min-1,霧化氣流速為0.85 L·min-1,采樣深度為7.0 mm,樣品提升速率為1.0 L·min-1,液氬壓力為0.7 MPa,脈沖電壓為850 V,樣品沖洗30 s,延遲20 s。數(shù)據(jù)采集重復(fù)測定3次,測定時將Ge和In作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行校正。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密吸取上述多元素的對照品溶液,用超純水稀釋制成每1 mL 中分別含下列元素的系列對照溶液:K 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Ca 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Na 25、50、125、250、500 ng,Mg 25、50、125、250、500,Al 100、200、500、1 000、2 000 ng,Zn 25、50、125、250、500 ng,Fe 100、200、500、1 000、2 000 ng,Mn 250、500、1 250、2 500、5 000 ng,Se 5、10、25、50、100 ng。分別精密吸取內(nèi)標(biāo)元素Ge和In對照品溶液(質(zhì)量濃度均為1 000 μg·mL-1)100 μL,置于100 mL量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,作為Ge和In對照品儲備溶液I(質(zhì)量濃度均為1 μg·mL-1)。另精密吸取Ge和In對照品儲備溶液I 1 mL,置于10 mL量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻,作為Ge和In對照品溶液(質(zhì)量濃度均為100 ng·mL-1)。

2.3 供試品溶液的配制

取樣品S1(批號191201)進(jìn)行粉碎,過2號篩,混勻備用,精密稱取上述粉末0.5 g,置于微波消解罐中,精密加入硝酸8 mL,混勻,然后旋緊外裝置,置于微波消解儀內(nèi),微波消解程序見表2。消解完成后進(jìn)行趕酸,調(diào)節(jié)溫度至120 ℃將硝酸揮發(fā)至1～2 mL時,用超純水將消解罐中的液體轉(zhuǎn)移至50 mL 聚四氟乙烯材料的量瓶中,加水稀釋至刻度,同時配制樣品空白溶液。

表2 微波消解儀工作條件Tab.2 Working conditions of microwave digestion

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2項下的9種元素混合系列對照品溶液,按照2.1項下的儀器工作條件進(jìn)行測定,內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管插入質(zhì)量濃度為100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液中,同時將進(jìn)樣管按照質(zhì)量濃度從小到大的順序插入各個混合系列對照品溶液中,每個樣品測定3次,以3次信號值的平均值為縱坐標(biāo)(y)、相對應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 9種微量元素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.3 Linear equations,correlation coefficients and linearity

2.5 精密度實驗

取2.2項下的9種微量元素混合系列對照品溶液,分別取K(1 250 ng·mL-1)、Ca(1 250 ng·mL-1)、Na(125 ng· mL-1)、Mg(125 ng· mL-1)、Al(500 ng·mL-1)、Zn(125 ng·mL-1)、Fe(500 ng·mL-1)、Mn(1 250 ng·mL-1)和Se(25 ng·mL-1)元素的混合對照品溶液,按照2.1項下的儀器工作條件進(jìn)行測定6次,測量記錄信號強度值。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se 的RSD 值分別為1.36%、1.88%、2.15%、1.38%、2.21%、1.55%、2.82%、3.06%、1.93%,RSD 值均小于4%,表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

取樣品S1,按照2.3項下的方法制備供試品溶液6份,按照2.1項下的儀器條件進(jìn)行測定,每個樣品重復(fù)測定3次,分別計算9種微量元素的含量。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se的平均含量分別 為21 260、250、930、2 260、50.18、49.65、63.56、55.50、0 mg·kg-1,RSD 值分別為1.22%、1.36%、0.98%、1.07%、2.34%、2.69%、3.11%、2.21%、0,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取樣品S1,按照2.3項下的方法制備供試品溶液,按2.1項下的儀器條件進(jìn)行測定,分別于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測定,記錄測定值。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se的RSD 值分別為2.52%、2.19%、2.77%、1.98%、3.28%、3.05%、2.65%、3.22%、0,RSD 值均小于4%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取樣品S1粉末0.25 g,平行制備6份樣品,置于消解罐內(nèi),每份按照樣品含量加入相應(yīng)的對照品溶液,按照2.3項下方法制備供試品溶液,同法制備空白溶液,按照2.1項下的儀器工作條件測定,分別計算9種微量元素的加樣回收率和RSD 值。結(jié)果見表4。

表4 9種微量元素的加樣回收率實驗結(jié)果 (n=6)Tab.4 Results of recovery tests of the 9 trace elements (n=6)

表4(續(xù)) 9種微量元素的加樣回收率實驗結(jié)果 (n=6)Tab.4(Continued) Results of recovery tests of the 9 trace elements (n=6)

2.9 檢出限

取2.3項下的空白溶液,按2.1項下的儀器工作條件測定,空白溶液平行測定11次,計算空白溶液中的K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn、Se 的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),k為各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,以3s/k作為各種被測元素的檢出限,以10s/k作為各種被測元素的定量限,計算各種元素的檢出限和定量限。計算得K、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se的檢出限分別為6.352、2.618、3.125、0.556、2.715、0.811、7.128、0.067、0.412 ng·mL-1;定量限分別為21.171、8.726、10.416、1.853、9.049、2.703、23.758、0.223、1.373 ng·mL-1。

2.10 樣品測定

取2019～2021年在各大藥材市場和超市收集的16批大葉茜草,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下儀器工作條件進(jìn)行測定,測量3次,取平均值,分別計算16批樣品中9種元素的含量。結(jié)果見表5。

表5 16批不同產(chǎn)地大葉茜草中9種微量元素的含量Tab.5 Results of 16 batches form different origins of the root of Rubia schumanniana Pritz.

2.11 相關(guān)性分析

本實驗通過對不同產(chǎn)地大葉茜草中9種微量元素含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,表明某些元素之間存在極顯著或顯著的相關(guān)性。相關(guān)性分析主要是對多個具備相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行分析,從而衡量不同組分間的聯(lián)系。當(dāng)P＜0.05時,表示在0.05水平上顯著性相關(guān);當(dāng)P＜0.01時,表示在0.01水平上極顯著性相關(guān)。本實驗的測定結(jié)果見表6。由表6可知,Ca與Na、Fe、Mn均呈極顯著性正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)分別為0.901(P＜0.01)、0.832(P＜0.01)和0.724(P＜0.01),表明在大葉茜草中Ca與Na、Fe、Mn具有一定的協(xié)同作用。

表6 大葉茜草中9種微量元素的Pearson相關(guān)性分析Tab.6 Pearson correlation analysis of the 9 trace elements in the root of Rubia schumanniana Pritz.

2.12 CA

用SPSS 20.0軟件對上述16個不同產(chǎn)地的大葉茜草中的9種微量元素含量測定結(jié)果進(jìn)行CA,用組間聯(lián)接方法、平均Euclidean距離進(jìn)行層次聚類。結(jié)果顯示,當(dāng)平均Euclidean距離為5時,16批樣品共分為6類,結(jié)果見圖1。其中S6、S9、S5、S13、S4聚為第一類;S7、S8聚為第二類;S1、S2聚為第三類;S10、S15、S12聚為第四類;S3、S14聚為第五類;S11為第六類。由圖1可知,相同類之間微量元素含量的相似度較高,不同類之間的差異較大,因此不同產(chǎn)地大葉茜草中9種微量元素含量的差異明顯,需要綜合各方面因素客觀評價產(chǎn)地的藥材質(zhì)量優(yōu)劣。

圖1 16個不同產(chǎn)地大葉茜草中9種微量元素的系統(tǒng)聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the 9 trace elements in the root of Rubia schumanniana Pritz.from different origins

2.13 PCA

為研究9種微量元素在不同產(chǎn)地大葉茜草微量元素變異中各自的貢獻(xiàn)率,用SPSS 20.0軟件對上述16個不同產(chǎn)地的大葉茜草中的9種微量元素測定結(jié)果進(jìn)行PCA。PCA 是將多個變量通過線性變換以降維方式轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)幾個變量,從而用少數(shù)變量去解釋樣品中大部分變異的新變量的方法。結(jié)果見表7。PCA 已經(jīng)將原來的變量重新組合成一組新的變量信息,根據(jù)Kaiser準(zhǔn)則(特征值大于1)及累計貢獻(xiàn)率達(dá)85%以上。由表7 可知,前3 個成分的特征值大于1,累計貢獻(xiàn)率達(dá)到88.9%,表明這3個成分可代表原始數(shù)據(jù)88.9%的變量信息,因此對這3個主成分進(jìn)行因子分析,結(jié)果見表8。由表8可知,第一個主成分因子中Ca、Na、Fe的負(fù)荷量較大,第二個主成分因子中Mg的負(fù)荷量較大,第三個主成分因子中無負(fù)荷量較大的元素,因此可以確定Ca、Na、Fe和Mg為大葉茜草的主要特征性微量元素。

表7 主成分的初始特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.7 Initial eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表8 3個主成分的因子載荷矩陣Tab.8 Factor loading matrix for 3 principal components

3 討論

3.1 微量元素的測定

各種微量元素不僅參與植物的生理代謝,也是植物次生代謝產(chǎn)物的構(gòu)成因子,元素的種類和含量的高低對中藥的生長以及臨床藥效發(fā)揮一定的作用,且不同產(chǎn)地的藥材所含微量元素的差異較大,因此對中藥所含的微量元素進(jìn)行檢測也是中藥質(zhì)量評價的重要指標(biāo)之一。目前對微量元素的測定主要采用原子吸收光譜法,但是用原子吸收光譜法測定時,每種元素需要特定發(fā)射波長的燈,分析速度慢。電感耦合等離子體方法在測定多種元素中具有較大的優(yōu)勢,可同時測定多種元素且分析速度快、靈敏度和準(zhǔn)確度高,因此適用于中藥材中多種微量元素的同時測定。

3.2 結(jié)果的判定

通過對16個不同產(chǎn)地的大葉茜草中9種微量元素進(jìn)行含量測定,并用聚類分析和主成分分析進(jìn)行綜合評價,結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地的大葉茜草中微量元素含量的差異較大,相同產(chǎn)地微量元素含量的差異較小,產(chǎn)自貴州遵義的大葉茜草中K、Ca和Na的含量均高于其他產(chǎn)區(qū),Se元素在大部分產(chǎn)地的大葉茜草中未檢出,K、Na和Mg 元素的含量遠(yuǎn)高于其他元素,K 的最高含量達(dá)26 273 mg·kg-1,其次為Mg(3 872 mg·kg-1)和Na(2 897 mg·kg-1),不同產(chǎn)地大葉茜草中Na元素含量的差異最大,這與當(dāng)?shù)氐耐寥馈夂蛞约吧鷳B(tài)環(huán)境有關(guān),因此需要對藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評價。

本實驗建立了同時測定不同產(chǎn)地16批大葉茜草中9種微量元素含量的ICP-MS方法,并對16批藥材中的9種微量元素進(jìn)行分析,探究它們之間的相似性。PCA 結(jié)果顯示,Ca、Na、Fe和Mg為其主要特征性微量元素,可以反映大葉茜草中其他多種元素的信息,是大葉茜草生長發(fā)育過程中的重要參與者。從含量測定結(jié)果可以看出,不同產(chǎn)地的大葉茜草中K 含量最高,其次是Mg和Na元素,這可能是因為K 是植物生長的必需元素,K 可以維持細(xì)胞的正常含水量,提高植物的抗旱和抗寒能力,因此含量較高。此外,通關(guān)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)不同元素之間具有顯著的相關(guān)性,表明植物的生長離不開多種微量元素的協(xié)同作用。本實驗的結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地大葉茜草中微量元素含量的差異較大,相同產(chǎn)地的差異較小,因此評價大葉茜草的質(zhì)量需要綜合各種因素進(jìn)行全面評價,選擇質(zhì)量較好的大葉茜草為臨床所用,從而保證臨床療效。