肖會敏 ,楊 旭 ,黃新文 ,羅歡歡 ,劉 洋 ,李 捷 ,黨學德*,王四旺*

1.陜西含光生物科技有限公司研發(fā)部,西安 710077;2.西北大學生命科學與醫(yī)學部,西安 710069;3.江西中醫(yī)藥大學,南昌 330004;4.西北農(nóng)林科技大學,楊凌 712100;5.空軍軍醫(yī)大學中藥與天然藥物教研室,西安 710032

小血藤[Schisandrapropinqua(Wall.) Baill.var.sinensisOliv.]又稱鐵箍散、香巴戟、血糊藤、鉆巖尖等,為五味子科五味子屬植物,全草入藥,10～11月采收,分布于陜西、甘肅、湖北、湖南、四川、云南、貴州等地,具有行氣止痛、活血散瘀等功效,常用于治療風濕麻木、筋骨疼痛、跌打損傷等[1-3]。其主要含有蘆丁、β-谷甾醇、對羥基苯乙醇苷等成分[4-9],其中蘆丁具有廣泛的藥理活性[10-11]。目前,針對小血藤的研究主要為化學成分的提取與鑒定及生物活性的分析[12-13],關于小血藤指紋圖譜與化學模式識別的研究尚未見報道。將指紋圖譜和化學模式識別技術結合具有良好的評價功能,廣泛應用于中藥鑒別、質量控制等領域[14-18]。本研究用高效液相色譜二極管陣列器法(high performance liquid chromatography photodiode array,HPLC-PDA)指紋圖譜技術建立24批不同產(chǎn)地的小血藤的綜合質量評價模式,對指紋圖譜數(shù)據(jù)進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA),以篩選其質量差異標志物。同時,測定小血藤中蘆丁、紫云英苷、槲皮素3種成分的含量,旨在從生產(chǎn)源頭確保藥材品質,亦為完善小血藤質量評價標準提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Prominence UFLC型高效液相色譜儀(配SPDM20A 二極管陣列檢測器)、LC/Labsoluion 色譜工作站、Shim-pack Scepter C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),均購自日本島津公司;十萬分之一電子分析天平(型號MD200,德國賽多利斯公司);KQ-5200DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(上海虔鈞科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品:蘆丁(批號B20771,質量分數(shù)≥98%),紫云英苷(批號B21704,質量分數(shù)≥98%),槲皮素(批號B20527,質量分數(shù)≥98%),均購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈為色譜純;水為純凈水。

24批不同產(chǎn)地小血藤(編號S1～S24),經(jīng)黨學德高級工程師鑒定,均為五味子科植物五味子屬小血藤[Schisandrapropinqua(Wall.) Baill.var.sinensisOliv.]的干燥藤葉。樣品信息見表1。

表1 小血藤樣品信息Tab.1 Sample information of Schisandra propinqua var.sinensis samples

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B),按表2中的程序進行梯度洗脫;記錄時間:80 min。流速:0.8 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測波長:300 nm;進樣量:20 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution procedure

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品適量,粉碎(過4號藥典篩),精密稱定上述粉末1.0 g,加入體積分數(shù)為50%的甲醇25 mL,稱定質量,超聲(功率為250 W,頻率為33 kHz)45 min,放涼,再次稱定質量,用體積分數(shù)為50%的甲醇補足減失的質量,混勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品蘆丁12.00 mg、紫云英苷14.00 mg、槲皮素16.60 mg,置于100 mL量瓶中,加甲醇制成3種成分質量濃度分別為117.60、137.20、162.68 μg·mL-1的混合對照品溶液,作為儲備液。

2.1.4 精密度實驗 取供試品溶液(S6),按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,以蘆丁為對照,記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰相對保留時間的RSD 值均小于2%,相對峰面積的RSD值均小于3%,表明方法的精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(S6),分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h,按2.1.1項下色譜條件進樣測定,以蘆丁為對照,記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰相對保留時間的RSD值均小于2%,相對峰面積的RSD值均小于3%,表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性實驗 取藥材樣品(S6)6份,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,再按2.1.1項下色譜條件進樣測定,以蘆丁為對照,記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰相對保留時間的RSD 值均小于2%,相對峰面積的RSD 值均小于3%,表明方法的重復性良好。

2.1.7 指紋圖譜的生成 取24 批藥材樣品,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,再按2.1.1項下色譜條件進樣測定,用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A 版)”,以S1為參照圖譜,建立24批小血藤樣品的指紋圖譜。疊加指紋圖譜見圖1,對照指紋圖譜見圖2。

圖1 24批樣品(S1～S24)和對照品(R)的HPLC 疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 24 batches of samples (S1-S24)and references (R)

2.1.8 共有峰的指認 通過將24批樣品的特征峰與混合對照品色譜峰比對,指認12 號峰為蘆丁,14號為紫云英苷,16號為槲皮素,見圖2。研究確認小血藤中蘆丁的含量較高,峰形穩(wěn)定且分離度較好,故將其作為對照峰,計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,24批樣品相對保留時間的RSD值均小于2.0%,相對峰面積的RSD值均小于99.82%。

圖2 樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig.2 HPLC control fingerprint of samples

2.1.9 相似度分析 用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A 版)”,以軟件生成的小血藤的共有模式圖為對照圖譜,進行相似度評價,見表3。結果顯示,陜南產(chǎn)樣品S1～S12的相似度均大于0.92,其余樣品的相似度均在0.745～0.912范圍內(nèi),表明不同產(chǎn)地小血藤的化學成分存在一定差異。

表3 相似度評價結果Tab.3 Results of similarity evaluation

2.2 聚類分析

以24批小血藤樣品的各共有峰峰面積為變量,用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件,以組間聯(lián)接平方歐氏距離為測度進行聚類分析[19-20],見圖3。由圖3可知,24批藥材樣品可聚為2類,S1～S16、S21、S22聚為Ⅰ類,Ⅰ類又可聚為2 類,S15、S16 為Ⅰa 類,S13、S14、S21、S22、S1～S12為Ⅰb類;S17～S19、S23、S24聚為Ⅱ類,Ⅱ類也可聚為2類,S19、S20為Ⅱa類,S17、S18、S23、S24為Ⅱb類。結果表明,陜南、甘肅產(chǎn)區(qū)及中部地區(qū)(湖南、湖北)與西南地區(qū)(四川、廣西、云南)產(chǎn)小血藤存在較明顯的地域差異。

圖3 24批樣品的聚類分析樹狀圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis for 24 batches of samples

2.3 PCA 分析

以共有峰的峰面積為變量,用SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件進行主成分分析。結果顯示,前5種主成分的方差貢獻率分別為36.16%、19.03%、17.47%、10.93%、8.30%,累積方差貢獻率為91.89%,表明前5種主成分可揭示藥材來源與22種共有成分的相關性,可反映藥材中大部分的差異信息。24批小血藤主成分分析得分圖見圖4。由圖4可見,不同產(chǎn)區(qū)的小血藤能夠較好地區(qū)分開,S1～S12分布于得分圖的右側、S13～S24分布于得分圖的左側,且S19～S20分布在外側。表明不同產(chǎn)區(qū)小血藤的化學成分存在差異,該結果與聚類分析的結果一致。結果見圖4、圖5。

圖4 24批小血藤主成分分析得分圖Fig.4 Score chart of principal component analysis of 24 batches of Schisandra propinqua var.sinensis

2.4 OPLS-DA 分析

OPLS-DA 擬合效果的評價指標主要是累積解釋能力參數(shù)(R2X、R2Y)和預測能力參數(shù)(Q2),若R2Y、Q2均大于0.5,則表示擬合效果較好,且越接近1越好[21]。將24批小血藤樣品按來源分為陜南產(chǎn)地組、其他產(chǎn)地組,用SIMCA 14.1 統(tǒng)計軟件進行OPLS-DA 分析,得分散點圖見圖5。由圖5可知,陜南產(chǎn)地組與其他產(chǎn)地組分別分布于得分散點圖的兩側,R2X=0.683,R2Y=0.998,Q2=0.994,R2Y、Q2均超過0.5。結果表明,OPLS-DA 預測模型可用于區(qū)分不同來源的小血藤,2組樣品的化學成分含量存在差異。

圖5 OPLS-DA 得分散點圖Fig.5 OPLS-DA score scatter plot

提取OPLS-DA 模型中22個共有峰峰面積的變量投影重要性(variable projection importance,VIP)值,并選擇其中VIP 值大于1的共有峰[22],見圖6。由圖6可知,VIP值大于1的色譜峰分別為12號峰(蘆丁,VIP值為3.05)、14號峰(紫云英苷,VIP值為1.84)、17 號峰(VIP 值為1.29)、6 號峰(VIP 值為1.07)、13號峰(VIP值為1.05),表明這5種化學成分是影響小血藤質量的差異標志物。

圖6 24批樣品OPLS-DA模型中22個共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of 22 common peaks in OPLS-DA model of 24 batches of samples

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 同2.1.1項色譜條件。

2.5.2 供試品溶液的制備 取樣品適量,粉碎(過4號藥典篩),精密稱定上述粉末1 g,加入體積分數(shù)為50%的甲醇25 mL,稱定質量,超聲(功率250 W,頻率33 kHz)提取45 min,放冷,再次稱定質量,用體積分數(shù)為50%的甲醇補足減失的質量,混勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.5.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品蘆丁12.00 mg、紫云英苷14.00 mg、槲皮素16.60 mg,置于100 mL量瓶中,加甲醇制成上述3種成分質量濃度分別為117.60、137.20、162.68 μg·mL-1的混合對照品溶液,作為儲備液。

2.5.4 標準曲線及線性范圍 分別精密量取儲備液0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mL,分別置于各個1 mL量瓶中,加甲醇定容至1 mL,分別得系列對照品溶液。進樣測定,記錄峰面積,考察對照品質量濃度(x)與峰面積(y)的線性關系,見表4。結果表明,各成分在相應質量濃度范圍內(nèi),線性關系良好。

表4 線性方程與范圍及相關系數(shù)Tab.4 Linear equations,ranges and correlation coefficients

2.5.5 系統(tǒng)適用性實驗 取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量,按2.2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,見圖7。

圖7 混合對照品、供試品及陰性對照品的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of mixed control,test and negative control

2.5.6 精密度實驗 取2.2.2 項下供試品溶液(S6),按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄蘆丁、紫云英苷、槲皮素峰面積。結果顯示,蘆丁、紫云英苷、槲皮素峰面積的RSD 值均小于2%,表明方法的精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(S6),分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h,按2.1.1項下色譜條件進樣,測定蘆丁、紫云英苷、槲皮素峰面積。結果顯示,蘆丁、紫云英苷、槲皮素峰面積的RSD值均小于2%,表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 重復性實驗 取藥材樣品(S6)6份,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,再按2.1.1項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算含量的RSD 值。結果顯示,蘆丁、紫云英苷、槲皮素峰面積的RSD 值均小于2%,見表5,表明方法的重復性良好。

表5 重復性實驗結果Tab.5 Repeatability test results

2.5.9 加樣回收率實驗 取小血藤樣品(S6)適量,共6份,按2.1.2 項下方法制備供試品溶液,再按2.1.1項下色譜條件進樣測定,記錄各峰面積。結果顯示,蘆丁、紫云英苷、槲皮素加樣回收率的RSD 值均小于3%,見表6,表明方法的重復性良好。

表6 加樣回收率實驗結果Tab.6 Test results of sample addition recovery

2.5.10 含量測定 取24批小血藤樣品,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,再按2.1.1項下色譜條件進樣測定,記錄各成分峰面積,計算含量,見表7。結果顯示,不同產(chǎn)地小血藤中各成分的含量有差異,陜南產(chǎn)小血藤中3種成分的含量較高,其他產(chǎn)地含量偏低。

表7 24批樣品含量測定結果Tab.7 Determination results of 24 batches of sample content

3 討論

3.1 色譜條件

本研究通過二極管陣列在200～800 nm 波長范圍內(nèi)對供試品溶液進行掃描后發(fā)現(xiàn),當檢測波長為300 nm 時,各色譜峰均有較強吸收,且分離度較好,故選擇300 nm 為檢測波長。比較了以甲醇-磷酸水溶液(0.5、1、2 mL·L-1)、乙腈-磷酸水溶液(0.5、1、2 mL·L-1)、乙腈-甲酸溶液(0.5、1、2 mL·L-1)等為流動相的分離效果。結果顯示,以乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液進行梯度洗脫時,色譜峰的分離度較好,故選擇將乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液作為流動相。

3.2 制樣方法

比較了加熱回流、冷浸和超聲(15、30、45、60 min)3種提取方法對樣品色譜峰的影響。結果顯示,樣品經(jīng)超聲提取色譜信息豐富、色譜峰響應強、分離度良好且雜質干擾少,故選擇超聲提取制備供試品溶液。

3.3 統(tǒng)計分析

24批小血藤樣品的相似度為0.745～0.985,其中陜南產(chǎn)區(qū)樣品的相似度較高,表明樣品的均一性較好;其他產(chǎn)區(qū)樣品的相似度較低(均小于0.92),表明不同產(chǎn)區(qū)樣品間質量存在差異。24批樣品相對峰面積的RSD 值差異較大(RSD 值為0～99.82%),表明其含量存在差異。本研究結果顯示,24批小血藤樣品可分為2類,主成分分析結果與該結果基本一致。蘆丁、紫云英苷、17號峰、6號峰、13號峰5種成分為影響小血藤藥材質量的差異標志物。含量測定結果顯示,24批樣品中,蘆丁、紫云英苷、槲皮素的含量分別在0.272 8～0.476 4、0.058 3～0.155 8、0.042 1～0.057 4 mg·g-1范圍內(nèi),各樣品間含量差異明顯。導致該差異的原因可能是各產(chǎn)地的地理環(huán)境、貯存及運輸條件等因素的不同[17]。

綜上所述,本研究建立的HPLC 指紋圖譜和含量測定方法簡便、穩(wěn)定性好,可為小血藤質量的評價及控制提供依據(jù)。不同產(chǎn)地小血藤中蘆丁、紫云英苷等成分的含量不同,可作為小血藤的差異標志物。