商偉偉, 索德成, 李 桐, 杜秋玲, 蔣先鴻, 王培龍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 北京 100081)

隨著國民經(jīng)濟(jì)生活水平的提高,人們對蛋白質(zhì)的需求日益增加,牛奶成為重要的蛋白質(zhì)補(bǔ)充來源。但近年來的研究發(fā)現(xiàn),牛奶中存在孕激素等多種危害物殘留[1-3]。孕激素由于其高生物活性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng),被認(rèn)為是內(nèi)分泌干擾物(EDCs)的典型污染物[4,5]。牛奶成分復(fù)雜,包括蛋白質(zhì)、脂肪及碳水化合物等大分子物質(zhì),對其中孕激素等痕量危害物的檢測一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此,針對牛奶中孕激素殘留,建立高效、便捷的前處理技術(shù)結(jié)合準(zhǔn)確的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

目前,關(guān)于牛奶中孕激素殘留檢測常用前處理方法包括液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、固相萃取法(solid phase extraction, SPE)、加速溶劑萃取法(accelerated solvent extraction, ASE)等。其中,固相萃取法由于其操作簡單、分析物預(yù)富集因子高、吸附劑可重復(fù)使用、使用有機(jī)溶劑體積少等優(yōu)點(diǎn),在各種萃取技術(shù)中得到了廣泛的認(rèn)可[6],相較于液液萃取,SPE具有有機(jī)溶劑用量少、提高萃取率、性價(jià)比較高等優(yōu)勢[7]。固相萃取材料是固相萃取的核心和關(guān)鍵,影響著SPE富集和凈化的性能。Guedes-Alonso等[8]利用織物相吸附萃取法(fabric phase sorptive extraction, FPSE)代替?zhèn)鹘y(tǒng)SPE技術(shù)提取牛奶中的類固醇激素,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析,使用內(nèi)標(biāo)法定量,方法簡便、快速,但萃取率相對較低。

圖 1 分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structural formulas of analytes

近年來,金屬有機(jī)框架材料(metal-organic frameworks, MOFs)作為一種新興功能材料,在氣體儲存[9,10]、傳感器[11]、吸附分離[12-16]、藥物傳遞[17,18]和分析預(yù)處理[19-21]等方面的應(yīng)用引起了研究人員的廣泛興趣。在不同的分析應(yīng)用中,特別是在樣品預(yù)處理中,MOFs由于其結(jié)構(gòu)拓?fù)洳煌?、孔徑可調(diào)、永久納米孔隙度、比表面積高和熱穩(wěn)定性良好,在環(huán)境和生物樣品的富集、分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[22,23]。Pang等[24]制備了金屬有機(jī)骨架-聚合物整體柱,作為固相萃取柱,成功地實(shí)現(xiàn)在線固相萃取并測定中草藥中的熊果酸。Jiang等[25]采用聚偏二氟乙烯物理包封的方法,將固體顆粒嵌入三聚氰胺泡沫中,制備了基于MIL-101(Cr)的泡沫柱,并作為一種高質(zhì)量的吸附材料用于植物油中三嗪類化合物的檢測。該泡沫柱的制備方法適用于多種金屬有機(jī)框架材料,并能保持其獨(dú)特的性能。Rahimpoor等[26]首次報(bào)道了一種基于3種MOFs(UiO-66、UiO-66-NH2和UiO-66-NH2@Fe3O4-SiO2)的分析方法,作為填充吸附劑(MEPS)萃取尿液中的反式,反式-1,3-丁二烯-1,4-二羧酸(tt-MA),方法靈敏、快速,可重復(fù)使用。目前,傳統(tǒng)的固相萃取柱制備工藝非常成熟,在復(fù)雜樣品中應(yīng)用廣泛。針對孕激素的SPE固相萃取柱主要包括C18、Oasis HLB、Prime HLB等,但其填料用量較多,使用時(shí)需進(jìn)行活化、淋洗等步驟,使實(shí)驗(yàn)操作繁雜,且無法二次使用。本研究篩選出一種比表面積大、水穩(wěn)定性好的鋯基金屬有機(jī)框架材料UiO-67,探究了UiO-67與孕激素間發(fā)生的化學(xué)作用,并將其作為固相萃取柱填料應(yīng)用于牛奶中孕激素的富集凈化,考察了影響孕激素萃取效果的主要參數(shù),結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)實(shí)現(xiàn)了牛奶中7種孕激素殘留的高靈敏測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Vanquish Flex UHPLC Systems超高效液相色譜、Q-Exactive四極桿-靜電場軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀、熱電噴霧電離(heatable electrospray source ion, HESI)源、K-Alpha X射線光電子能譜(XPS)(美國Thermo公司), N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司), 3K15高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司), Smart Lab3 X射線衍射儀(XRD,日本理學(xué)公司), Tensor Ⅱ傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR,德國Bruker公司), SU 3500掃描電子顯微鏡(SEM,日本日立公司), Milli-Q超純水儀(法國Merck公司)。

7種孕激素標(biāo)準(zhǔn)品(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1):美侖孕酮(melengestrol, MLG)、甲地孕酮(megestrol, MG)、17α-羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone, 17α-HPT)、左炔諾孕酮(levonorgestrel, LG)、孕酮(progesterone, PT)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,烯丙孕素(altrenogest, AT)購自美國TargetMol公司,甲羥孕酮(medroxyprogesterone, MP)購自上海源葉生物科技有限公司,以上均為純品型粉末,純度大于98%。氯化鋯(ZrCl4)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,4,4′-聯(lián)苯二甲酸購自北京華威銳科化工有限公司,無水硫酸鎂購自北京易豐源生物科技有限公司,所用甲酸、乙酸、甲醇、乙腈、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(HPLC級,德國CNW公司),實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純化后的超純水。

儲備液的配制:分別稱取20 mg標(biāo)準(zhǔn)品粉末,加入40 mL甲醇溶解,各配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液。各取適量500 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋為10 mg/L的孕激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,備用。以上所有標(biāo)準(zhǔn)液均于-20 ℃冷藏保存。

1.2 材料的合成

在文獻(xiàn)[27]基礎(chǔ)上,采用溶劑熱法合成UiO-67。準(zhǔn)確稱量ZrCl446.6 mg與4,4′-聯(lián)苯二甲酸48.4 mg于聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中,向其中加入20 mLN,N-二甲基甲酰胺后,放入超聲清洗器中超聲混勻,然后加入0.2 mL乙酸使其充分混合后,放入120 ℃烘箱中反應(yīng)24 h。用DMF和丙酮各清洗3次后,在50 ℃烘箱中過夜干燥。

1.3 固相萃取柱的制備

加入垂直放置的、裝有多孔聚乙烯篩板的5 mL聚丙烯管中,一次性裝入自制材料UiO-67 40 mg,多次輕敲管壁使其分布均勻,將另一片多孔聚乙烯篩板放置在填料上方后壓緊,使填料上方表面平齊并密實(shí),制成40 mg/5 mL固相萃取小柱。

1.4 UiO-67對孕激素的吸附性研究

向3 mL含有1 mg/L和5 mg/L的7種孕激素溶液中分別加入3 mg UiO-67,在28 ℃, 240 r/min設(shè)定條件下?lián)u床振蕩30 min,使孕激素被UiO-67充分吸附,然后離心1 min,取上清液1 mL過濾膜(尼龍,0.22 μm),使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS進(jìn)行檢測。吸附效率=(1-孕激素吸附后測得峰面積/孕激素吸附前測得峰面積)×100%。

1.5 樣品前處理

1.5.1樣品的提取

用移液槍準(zhǔn)確吸取5 mL牛奶于50 mL離心管中,向其中加入10 mL乙腈,室溫下超聲提取15 min,于4 ℃下離心10 min,將提取液全部倒入盛有2 mg無水硫酸鎂的離心管中,渦旋后離心10 min,取上層清液于試管中,在50 ℃下氮吹至近干后,用5 mL pH=5的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶,待凈化。

1.5.2樣品的凈化

取全部復(fù)溶液過UiO-67填裝的固相萃取小柱,以1 mL/min的流速緩慢通過固相萃取柱,使其充分吸附,然后加入5 mL丙酮通過固相萃取小柱進(jìn)行洗脫,收集全部洗脫液,在50 ℃下氮吹至近干后用0.5 mL乙腈-水(1∶1, v/v)復(fù)溶,渦旋混勻后過濾膜,進(jìn)樣體積為5 μL,使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS檢測。

1.6 儀器條件

1.6.1液相色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;柱溫:40 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。梯度洗脫條件:0～0.5 min, 30%B; 0.5～1.0 min, 30%B～45%B; 1.0～8.0 min, 45%B～90%B; 8.0～8.8 min, 90%B; 8.8～10.0 min, 90%B～30%B。

1.6.2質(zhì)譜條件

采用HESI源,7種孕激素均采用正離子掃描模式,平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)模式;鞘氣流速:40 Arb;輔助氣流速:10 Arb;噴霧電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;透鏡電壓:55 V;輔助氣加熱溫度:300 ℃;容納離子數(shù)目:2.0×104;分辨率:30 000;隔離窗口:m/z2.0;離子注入時(shí)間:50 ms;脫孔劑氣和錐孔氣均為氮?dú)?。除了甲地孕酮的碰撞能量?5 eV,其余均設(shè)置為30 eV。目標(biāo)化合物的其余質(zhì)譜參數(shù)見表1, 7種孕激素的色譜圖見圖2。

表 1 目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

圖 2 7種孕激素的選擇離子流色譜圖Fig. 2 Selected ion current chromatograms of the seven progesterones

圖 3 UiO-67的(a)掃描電鏡圖、(b)X射線衍射光譜圖和(c)紅外光譜圖Fig. 3 Images of (a) the scanning electron microscope,(b) the X-ray diffraction spectrogram and (c) the infrared spectrogram of UiO-67

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

采用掃描電子顯微鏡、X射線衍射光譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀對獲得的UiO-67進(jìn)行表征。

如圖3a所示,UiO-67的形貌為八面體,尺寸約為84 nm,邊長約為60 nm。在5°～40°范圍內(nèi)模擬了UiO-67的粉末X射線衍射圖(見圖3b),在2θ≈5°、6°、12°時(shí)的衍射峰和先前文獻(xiàn)[28]報(bào)道吻合;紅外光譜圖(見圖3c)表明,在波段為660 cm-1和770 cm-1處出現(xiàn)Zr-O鍵,1 385 cm-1附近出現(xiàn)Zr-OH鍵,1 500～1 650 cm-1處出現(xiàn)C-O-Zr鍵,這與模擬的UiO-67紅外光譜圖一致,說明材料已被成功制備。

此外,采用X射線光電子能譜儀對UiO-67吸附孕激素前和吸附后進(jìn)行測試,吸附前后Zr、C、O的譜圖發(fā)生變化。與吸附前相比,UiO-67吸附孕激素后,Zr 3d的譜峰向右稍微偏移,Zr 3d5/2的結(jié)合能由182.62 eV移至182.29 eV, Zr 3d3/2的結(jié)合能由185.0 eV移至184.67 eV,說明孕激素與Zr團(tuán)簇間存在相互作用,Zr作為得電子方發(fā)生了化學(xué)吸附;UiO-67中C 1s譜可分為3個(gè)峰,分別對應(yīng)官能團(tuán)C-C/C=C、C-O和C=O,孕激素本身結(jié)構(gòu)含有C-C、C=C,所以當(dāng)UiO-67吸附孕激素后,C-C/C=C相對含量明顯增加,由74.20%增加至87.67%,而C-O和C=O的相對含量減少了13.46%;對比UiO-67吸附孕激素前后的O 1s譜圖變化,各個(gè)峰略有偏移,整體結(jié)合能減少,Zr-O-Zr、Zr-OH、O-C=O的相對含量也均有減少,而Zr-OH2的相對含量增加了17.29%,說明UiO-67與孕激素之間存在化學(xué)作用。

2.2 UiO-67對孕激素的吸附性

向等體積、不同含量的(1 mg/L和5 mg/L)孕激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入等量的UiO-67進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示,UiO-67對1 mg/L的孕激素溶液吸附效率為99.73%～99.95%,對5 mg/L的孕激素溶液吸附效率相較之略低,為88.87%～99.23%,充分證明了這種材料對孕激素的高效吸附性,從而保證在較低孕激素濃度水平下能夠順利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖 4 UiO-67對孕激素的吸附效率(n=3)Fig. 4 Adsorption efficiencies of progesterones with UiO-67 (n=3)

圖 5 (a)吸附劑用量、(b)洗脫溶劑類型和(c)pH值對孕激素萃取回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effects of (a) amount of sorbent, (b) type of eluent and (c) pH value on the extraction recoveries of progesterones (n=3)

2.3 固相萃取條件優(yōu)化

2.3.1吸附劑用量

選取不同質(zhì)量的吸附劑(30、40、50、60 mg)分別填裝固相萃取柱,研究吸附劑用量對孕激素回收率的影響。結(jié)果如圖5a所示,吸附劑用量為30 mg時(shí),孕激素回收率為45.73%～88.74%,回收率較低,可能由于磷酸鹽離子堵塞孔道導(dǎo)致吸附不完全;當(dāng)吸附劑用量增加至40 mg時(shí),回收率可達(dá)到90%以上;繼續(xù)增加用量至50 mg和60 mg,孕激素回收率明顯下降,可能因?yàn)橄疵撊軇┯昧坎蛔?難以充分洗脫。由此可見,吸附劑用量為40 mg時(shí)即可以滿足孕激素的充分萃取,用量過少或過多會(huì)導(dǎo)致萃取率較低。

2.3.2洗脫溶劑類型

這7種孕激素屬于極性化合物,結(jié)合它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看,含有羰基、羥基、甲基,同時(shí)具備了親水和疏水基團(tuán),但激素化合物不溶于水,故本實(shí)驗(yàn)選擇了強(qiáng)極性溶劑進(jìn)行洗脫,如甲醇、乙腈、丙酮(見圖5b)。顯而易見,用丙酮洗脫后的孕激素回收率最好,這可能由于丙酮滲入材料內(nèi)部使其孔徑膨脹[29],使目標(biāo)物順利從材料中洗脫下來,因此洗脫溶劑選擇丙酮。

2.3.3溶液pH值

牛奶本身呈弱酸性,正常pH值在6～7之間,而樣品溶液的pH值對于目標(biāo)物的萃取起到非常重要的作用,因此考察了pH在2～9范圍內(nèi)UiO-67對孕激素的萃取效果(見圖5c)。樣品溶液pH=2時(shí),孕激素的萃取率低至20%左右;當(dāng)溶液pH上調(diào)至5時(shí),回收率顯著增加至85%以上;繼續(xù)調(diào)節(jié)溶液pH為7和9時(shí),回收率顯著降低?？赡芤?yàn)槿芤簆H過高或過低,會(huì)使UiO-67和孕激素同時(shí)帶負(fù)電荷或正電荷,產(chǎn)生靜電排斥作用。因此,選取pH=5作為最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在UHPLC-Q-Orbitrap HRMS檢測中,基質(zhì)效應(yīng)會(huì)造成背景干擾信號強(qiáng),掩蓋痕量有機(jī)化合物的出峰,容易出現(xiàn)假陽性目標(biāo)化合物,從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。若想在檢測方法中消除基質(zhì)效應(yīng),必須對基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱進(jìn)行評估。本實(shí)驗(yàn)通過比較標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率大小,來評估基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱。

將標(biāo)準(zhǔn)工作液用甲醇依次稀釋成不同質(zhì)量濃度(1、2、20、50、100 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后按照上述方法,用空白牛奶提取液將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照以上建立的分析方法進(jìn)行檢測。以7種孕激素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),孕激素的色譜峰面積為縱坐標(biāo),分別在1～100 μg/L范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)公式ME=(A-B)/A×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。其中,A代表純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率;B代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。若ME>0,表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),若ME<0,表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)0≤|ME|≤20%時(shí),說明基質(zhì)對信號干擾較低,可忽略不計(jì);當(dāng)20%<|ME|<50%時(shí),表現(xiàn)為中等強(qiáng)度的基質(zhì)干擾,而當(dāng)|ME|≥50%,則為強(qiáng)基質(zhì)干擾。牛奶中美侖孕酮、左炔諾孕酮、孕酮表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),甲地孕酮、17α-羥孕酮、烯丙孕素、甲羥孕酮表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),但|ME|均在0%～20%內(nèi),基質(zhì)對孕激素信號干擾較低(見圖6)。牛奶中的孕激素經(jīng)過提取與凈化,基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì),無需使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

圖 6 孕激素在牛奶中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)Fig. 6 Matrix effects of progesterones in milk (n=3)

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

在1～100 μg/L孕激素混合溶液范圍內(nèi),7種孕激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表2所示。7種孕激素線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,說明孕激素在此范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好。在空白基質(zhì)溶液中添加不同濃度的激素化合物,從低濃度到高濃度依次進(jìn)行上機(jī)檢測,以信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限為0.06～0.30 μg/L,以S/N≥10確定方法的定量限為0.19～1.0 μg/L。

表 2 孕激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2回收率、精密度

在牛奶中分別添加1 μg/L和5 μg/L水平的7種孕激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述優(yōu)化好的樣品前處理方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn),然后上機(jī)檢測。檢測結(jié)果見表3,在1 μg/L和5 μg/L孕激素添加水平下,回收率為87.10%～105.58%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.66%～9.64%。

表 3 孕激素在不同添加水平下的回收率和精密度(n=3)

2.6 實(shí)際樣品檢測

在超市購買國內(nèi)牛奶(1號、2號)和國外牛奶(3號、4號),同時(shí)按照上述優(yōu)化的固相萃取條件進(jìn)行處理,選取良好的儀器狀態(tài),使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS測定,結(jié)果見表4。該方法檢測到牛奶中含有內(nèi)源性激素(17α-羥孕酮、孕酮)和人工合成類激素(甲地孕酮、左炔諾孕酮、甲羥孕酮),未檢測到美侖孕酮和烯丙孕素,可能喂養(yǎng)奶牛的飼料或飲用水中使用了激素類藥物,導(dǎo)致牛奶中激素殘留。孕酮在不同品牌的牛奶中檢測濃度較高,這與奶牛處于的生長階段相關(guān)。孕酮的檢測結(jié)果在14.32～20.12 μg/L范圍內(nèi),與標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1980-2007得到的檢測結(jié)果比較吻合,更具有說服力。而且相較于標(biāo)準(zhǔn)方法,該方法使用外標(biāo)法定量,簡化操作步驟,是一項(xiàng)有參考意義的前處理和檢測方法。此外,飼養(yǎng)動(dòng)物過程中,值得注意的是孕酮含量以及人工合成類激素的使用。

2.7 與其他方法比較

將之前報(bào)道的牛奶中孕激素前處理方法[30-37]與該方法進(jìn)行比較,對方法的檢出限、定量限和回收率以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行匯總,如表5所示,該方法檢出限較低,且能夠獲得滿意的回收率,具有高效、準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)牛奶中微量孕激素的富集檢測。

表 4 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法對牛奶中孕激素含量的測定

表 5 本方法與其他方法的比較

3 結(jié)論

本研究利用UiO-67作為固相萃取填料,結(jié)合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS成功建立了同時(shí)富集測定牛奶中7種孕激素的分析方法。其中UiO-67作為固相萃取柱材料穩(wěn)定性好,生產(chǎn)成本較低,應(yīng)用該方法可減少固相萃取柱的活化步驟,既能節(jié)省時(shí)間,又防止溶劑浪費(fèi),提高實(shí)驗(yàn)效率。而且通過與傳統(tǒng)前處理方法比較,該方法性能優(yōu)異,能夠?qū)崿F(xiàn)牛奶中孕激素高靈敏、多殘留檢測,為牛奶中其他潛在危害物的富集檢測提供新的參考。