阮鵬 何春萍 黃超 周瑞

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行。慢性乙型肝炎(CHB)可以導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(HCC), HBV感染過程中病毒整合入肝細(xì)胞是HBV相關(guān)性HCC的重要誘因[1]。HBV感染后，病毒成熟體(Dane顆粒)黏附于宿主肝細(xì)胞表面并進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，部分病毒基因成份進(jìn)入肝細(xì)胞核內(nèi)部，疏松環(huán)狀結(jié)構(gòu)(rcDNA)轉(zhuǎn)變成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)，有部分DNA片斷整合入宿主細(xì)胞核。HBV整合的檢測(cè)方法包括Alu-PCR，反向巢式PCR (invPCR)，高通量測(cè)序技術(shù)(WGS)等[ 2-4]，大多耗時(shí)費(fèi)力或價(jià)格昂貴。本研究探討通過改良Alu-PCR技術(shù)檢測(cè)HBV整合的可能性，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞(上海復(fù)祥生物科技有限公司)，DNA通過QIAamp○RDNA Mini試劑盒(Qiagen)抽提。Alu-PCR定量檢測(cè)HBV整合位點(diǎn)，采用48孔培養(yǎng)平板再次培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞。 20 μmol/L雙氧水(H2O2)加入其中24孔，抽提細(xì)胞作為治療組。另外24孔細(xì)胞未加入H2O2作為對(duì)照組 。

二、 HBV整合檢測(cè)

將傳統(tǒng)HBV檢測(cè)的Alu-PCR技術(shù)進(jìn)行改良簡化。Alu序列引物包括外側(cè)引物A5(5′CAGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCCAAAGTGC-TGGGATTACAG 3′，5′末端劃線部分為附加于Alu序列外的Tag序列) 和內(nèi)側(cè)引物Tag5(5′ CAAGTGTTTGCTGACGCCAAAG 3′)。設(shè)計(jì)HBV序列外側(cè)引物 HB1(5′ AAAGGACGTCCCGCGCAG 3′) 和內(nèi)側(cè)引物HB2 (5′ CACAGCCTAGCAGCC-ATGG 3′)(上海生工科技有限公司合成)。對(duì)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中提取的DNA均采用Alu-PCR技術(shù)檢測(cè)進(jìn)行比較。第一輪擴(kuò)增的引物為A5和HB1。在25 μL PCR體系中含2.5 μL PCR 10×Taq緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、10 μmol/L引物各1 μL、1 μL細(xì)胞DNA，0.1 μLTaqDNA聚合酶，加ddH2O至總體積25 μL。94℃預(yù)變性1 min，每次循環(huán)包括94℃ 30 s，59℃ 30 s，70℃ 3 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，94℃ 1 min中止反應(yīng)。PCR體系中加入引物A5和HB1各0.5 μL進(jìn)行降落PCR。94℃預(yù)變性1 min，94℃ 30 s、65℃降落至55 ℃，72 ℃ 3 min的條件下進(jìn)行10次循環(huán)(每輪循環(huán)降1℃)，再在退火溫度保持55℃的條件下進(jìn)行20次循環(huán)。然后取1 μL PCR產(chǎn)物做模板，采用引物Tag5和HB2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，除引物和DNA模板外，PCR體系其他成分同前。擴(kuò)增條件最終優(yōu)化為：94℃預(yù)變性2 min，每次循環(huán)包括95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物凝膠回收后送大連寶生物公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)BLAST檢索(BLAST; http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr)。

三、HepG2.2.15細(xì)胞HBV整合位點(diǎn)和cccDNA定量檢測(cè)

對(duì)加入和未加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中檢測(cè)到的HBV整合位點(diǎn)及cccDNA進(jìn)行定量檢測(cè)。凝膠回收用改良Alu-PCR法擴(kuò)增出的HepG2.2.15細(xì)胞HBV整合片段，PMD 18-T載體連接后轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞。加入LB液體培養(yǎng)基使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)后涂布于LB瓊脂平板上培養(yǎng)。藍(lán)、白斑篩選、質(zhì)粒抽提并10倍稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品。為進(jìn)行該整合位點(diǎn)定量檢測(cè)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)Alu-R引物(5′ AAAGTGCTGGGATTACAG 3′)和HB2配對(duì)。采用SYBR Green I 熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)，20 μL反應(yīng)體系中含1 μL細(xì)胞DNA、10 μmol/L引物各1 μL、7 μL ddH2O和10 μL 2X SYBR Green I。反應(yīng)條件同Alu-PCR第二輪擴(kuò)增，72℃采集熒光信號(hào)。RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞cccDNA水平[5]。 LightCycler control DNA試劑盒檢測(cè)β-珠蛋白DNA來計(jì)算肝組織細(xì)胞數(shù)目。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、HBV整合檢測(cè)

改良Alu-PCR法在HepG2.2.15細(xì)胞中擴(kuò)增出194 bp片段，HepG2細(xì)胞中則未擴(kuò)增出(圖1)。 測(cè)序分析顯示該片段包括158 bp的HBV序列、20 bp的Alu重復(fù)序列及16 bp的Alu引物中Tag序列，為一插入Alu序列的HBV整合特異性擴(kuò)增片段，其病毒結(jié)合位點(diǎn)位于1 228 nt。該位點(diǎn)病毒整合片段長度至少為193 bp (1 421～1 228 nt)，因?yàn)镠B1引物的序列為1 421～1 404 nt(圖2)。

注：M.DNA Marker(DL 100bp)；1.HepG2細(xì)胞；2.HepG2.2.15細(xì)胞

注：A. 嵌合體片斷Sanger測(cè)序結(jié)果；B. 病毒-宿主嵌合端BLAST檢索：包含3bp的同源序列(CTG)，病毒結(jié)合處為P區(qū)1 228nt

二、HepG2.2.15細(xì)胞中該整合位點(diǎn)及cccDNA的定量檢測(cè)

加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中該整合位點(diǎn)水平為(-1.13±0.07)lg拷貝/細(xì)胞，未加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中其水平為(-2.10±0.82)lg拷貝/細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中cccDNA水平為(-1.94±1.45)lg拷貝/細(xì)胞，未加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中其水平為(-1.79±1.40)lg拷貝/細(xì)胞，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.915)。HepG2.2.15細(xì)胞該整合位點(diǎn)和cccDNA水平無顯著相關(guān)性(P=0.463)。

討 論

HBV整合的致癌機(jī)制包括：①影響整合位點(diǎn)周圍宿主基因的功能，如抑癌基因的失活或表達(dá)抑制、或癌基因的過表達(dá)激活；②宿主細(xì)胞基因組不穩(wěn)定；③免疫逃避下的克隆擴(kuò)增等[6,7]。Alu-PCR是利用宿主基因中大約每間隔4 kb存在一段Alu重復(fù)序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)HBV和Alu重復(fù)序列的嵌合引物，從而檢測(cè)出HBV 與肝細(xì)胞DNA結(jié)合位點(diǎn)的經(jīng)典技術(shù)。其技術(shù)要點(diǎn)包括:①為避免Alu引物間的重復(fù)擴(kuò)增，Alu引物中的三磷酸脫氧胸腺苷酸(dTTP)用三磷酸脫氧尿苷酸(dUTP)代替。在擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)之后，反應(yīng)體系中加入1 μL尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)來滅活dUTP從而破壞Alu引物；②第二階段采用降落PCR用來提高反應(yīng)的特異性和敏感性；③為提高擴(kuò)增效率，采用非對(duì)稱PCR技術(shù)(HBV引物濃度為Alu引物濃度的10倍)[2]。其缺陷在于無法檢測(cè)到遠(yuǎn)離Alu重復(fù)序列的HBV整合片段。

本研究將傳統(tǒng)Alu-PCR技術(shù)改良如下: ①Alu引物中仍采用dTTP從而有效降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用(dUTP價(jià)格昂貴)，無需在降落PCR前加入U(xiǎn)DG來破壞Alu引物；②HBV引物和Alu引物濃度相同；③重新設(shè)計(jì)位于P區(qū)的HBV引物。結(jié)果表明：①HBV整合片段在HepG2.2.15細(xì)胞并未在HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增出來，證明其為特異性而不是宿主-宿主基因或病毒-病毒基因的非特異性擴(kuò)增片段；②該HBV整合位點(diǎn)的嵌合片段宿主端為Alu重復(fù)序列，病毒結(jié)合端為HBP(1 228 nt)，長度僅為194 bp，有效避免了傳統(tǒng)Alu-PCR檢測(cè)中HBV整合位點(diǎn)可能遠(yuǎn)離Alu重復(fù)序列無法測(cè)出、長片段PCR可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增等缺陷；③該整合位點(diǎn)嵌合片段有3 bp的同源序列(CTG)，提示其病毒-宿主基因的連接方式為微同源末端連接[8]。

HBV整合是CHB患者致癌的重要誘因之一，但其發(fā)生機(jī)制和時(shí)間并不十分清楚。研究表明，HBV持續(xù)感染可使肝細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)產(chǎn)量增多，導(dǎo)致細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DSB)加重其細(xì)胞損傷并形成惡性循環(huán)。另一方面，ROS對(duì)肝細(xì)胞DNA的持續(xù)損傷可導(dǎo)致整合肝細(xì)胞選擇性克隆擴(kuò)增、整合片段通過失去復(fù)制能力從而逃避宿主免疫反應(yīng)[1]。由于H2O2可導(dǎo)致靶細(xì)胞DSB形成，可以通過在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)加入H2O2來模擬ROS導(dǎo)致細(xì)胞損傷[9]。本研究通過加入H2O2從而加重HepG2.2.15細(xì)胞DNA損傷，并定量檢測(cè)該插入Alu重復(fù)序列整合位點(diǎn)來探討HBV持續(xù)感染所導(dǎo)致的整合肝細(xì)胞克隆擴(kuò)增情況。結(jié)果表明，加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中該整合位點(diǎn)水平顯著高于未加入H2O2的細(xì)胞，證明在肝細(xì)胞持續(xù)損傷狀態(tài)下存在整合細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增并可能導(dǎo)致HCC發(fā)生。cccDNA是HBV原始復(fù)制模板，是宿主肝細(xì)胞持續(xù)感染和抗病毒治療后產(chǎn)生耐受和停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。本研究表明加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞中cccDNA水平未顯著高于未加入H2O2的HepG2.2.15細(xì)胞，所檢測(cè)的細(xì)胞該整合位點(diǎn)和cccDNA水平?jīng)]有顯著相關(guān)性。這種差異可能源于cccDNA和HBV整合的不同來源：前者主要來源于rcDNA反復(fù)進(jìn)入肝細(xì)胞核，后者則可能來源于整合肝細(xì)胞的克隆擴(kuò)增[10]。

總之，通過重新設(shè)計(jì)HBV引物、采用改良Alu-PCR技術(shù)在HepG2.2.15細(xì)胞中檢測(cè)到插入Alu重復(fù)序列的HBV整合位點(diǎn)，有效簡化了實(shí)驗(yàn)步驟和節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，降低了HBV整合研究的門檻。對(duì)該整合位點(diǎn)的定量檢測(cè)顯示肝細(xì)胞持續(xù)損傷可導(dǎo)致HBV整合細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)克隆擴(kuò)增，其插入病毒序列全長、對(duì)鄰近基因的調(diào)控作用等有待進(jìn)一步研究。