全敏 邢卉春

NS5ATP9是丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)反式激活基因，在多種惡性腫瘤細(xì)胞及癌組織中高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡，DNA損傷后修復(fù)等[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，NS5ATP9在細(xì)胞饑餓時(shí)表達(dá)增加，有抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的作用，此外其可以上調(diào)Beclin 1的表達(dá)，促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，而B(niǎo)eclin 1與多種腫瘤發(fā)展關(guān)系密切，抑制Beclin 1表達(dá)能增強(qiáng)肝癌對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性[5-8]。本實(shí)驗(yàn)探討B(tài)eclin 1是否參與了NS5ATP9抑制饑餓誘導(dǎo)的肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞[9]及pcDNA3.1/myc-His(-)-NS5ATP9(pNS5ATP9)表達(dá)載體及對(duì)照空載體pcDNA3.1/myc-His(-)(pNC)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。NS5ATP9 siRNA(si-NS5ATP9)和Beclin 1 siRNA(si-Beclin 1，sc-29797) 和各自的對(duì)照載體(二)si-NC由santa Cruz公司合成[10]。 細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、平衡鹽溶液EBSS及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑盒jetPRIMETM購(gòu)自美國(guó)Polyplus Transfection公司；caspase-Glo○R3/7試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞用DMEM(含10%胎牛血清)于體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒或siRNA及相應(yīng)對(duì)照。

(二)細(xì)胞總蛋白抽提 細(xì)胞裂解液(5872 s, CST, 美國(guó))裂解細(xì)胞，提取總蛋白，完成蛋白定量。用12% NUPAGE Bis-Tris凝膠電泳(NP0034，Invitrogen，Grand Island，美國(guó))。然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(ISEQ00010，Milipore，Billerica，美國(guó)) ；用5%脫脂奶粉配置1×TBST封閉液，依次與一抗Beclin 1 抗體 (3495，CST，美國(guó))、NS5ATP9抗體 (ab56773，Abcam, 香港)、GAPDH 抗體(5174，CST)、bax 抗體(2772，CST，美國(guó))、β-Actin 抗體(4967，CST，美國(guó))及二抗反應(yīng)。最后顯色，置于成像儀下曝光顯影，保存圖像。

(三)胱冬肽酶-3/7酶活性檢測(cè) caspase-3作為凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，通過(guò)caspase-3/7活性檢測(cè)可反映細(xì)胞凋亡的程度。按照試劑盒操作檢測(cè)caspase-3/7活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

結(jié) 果

一、NS5ATP9與bax蛋白表達(dá)

EBSS培養(yǎng)細(xì)胞0、6、12、18、24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)NS5ATP9、Beclin1、bax蛋白表達(dá)量的變化。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，NS5ATP9蛋白表達(dá)量逐漸升高，bax的表達(dá)呈升高趨勢(shì)(圖1)。

圖1 饑餓HepG2細(xì)胞6、12、18、24 h后，NS5ATP9蛋白表達(dá)升高，bax蛋白表達(dá)升高

二、NS5ATP9表達(dá)增加或抑制后，bax表達(dá)量呈相反變化

將si-NS5ATP9或pNS5ATP9轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h，EBSS饑餓細(xì)胞24 h，提取總蛋白檢測(cè)NS5ATP9、bax蛋白表達(dá)量的變化。NS5ATP9表達(dá)增加組bax的表達(dá)量有下調(diào)趨勢(shì)，NS5ATP9表達(dá)抑制組bax蛋白表達(dá)量有上調(diào)趨勢(shì)(圖2)。

注：pNS5ATP9(+表示pNS5ATP9轉(zhuǎn)染組，-表示對(duì)照載體轉(zhuǎn)染組)；si-NS5ATP9(+表示si-NS5ATP9轉(zhuǎn)染組，-表示對(duì)照si-NC轉(zhuǎn)染組)

三、Beclin 1表達(dá)被抑制后，NS5ATP9對(duì)凋亡的抑制作用減弱

在轉(zhuǎn)染si-Beclin 1 24 h后再轉(zhuǎn)染NS5ATP9過(guò)表達(dá)載體(pNS5ATP9)24 h，EBSS培養(yǎng)細(xì)胞24 h。與對(duì)照組相比，si-Beclin 1轉(zhuǎn)染組，caspase-3/7活性顯著增加；與對(duì)照組相比，pNS5ATP9轉(zhuǎn)染組，caspase-3/7活性顯著降低；在pNS5ATP9轉(zhuǎn)染的兩組組內(nèi)比較，si-Beclin 1轉(zhuǎn)染組caspase-3/7活性顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 pNSATP9及si-Beclin 1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后caspas3/7相對(duì)活性變化

四、Beclin 1表達(dá)被抑制后，NS5ATP9對(duì)bax下調(diào)作用減弱。

在HepG2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染si-Beclin 1 24 h后轉(zhuǎn)染NS5ATP9過(guò)表達(dá)載體(pNS5ATP9)24 h，EBSS培養(yǎng)細(xì)胞24 h。與對(duì)照組相比，NS5ATP9過(guò)表達(dá)組bax的表達(dá)量減少。

在si-Beclin 1轉(zhuǎn)染的兩組組內(nèi)比較，NS5ATP9過(guò)表達(dá)組bax表達(dá)量減低，在NS5ATP9過(guò)表達(dá)的的兩組組內(nèi)比較，si-Beclin 1轉(zhuǎn)染組，bax表達(dá)量增加。說(shuō)明Beclin 1被抑制后，削弱了NS5ATP9對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的抑制作用(圖3)。

圖3 先后轉(zhuǎn)染si-Beclin 1及pNS5ATP9 24 h后，饑餓HepG2細(xì)胞24 h bax蛋白表達(dá)量

討 論

NS5ATP9在肝癌組織較癌旁組織及正常肝組織中表達(dá)明顯升高，與肝癌的分期、惡性程度、不良預(yù)后相關(guān)，尋找NS5ATP9在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制對(duì)防治肝癌有重要價(jià)值[11-13]。

NS5ATP9可以上調(diào)Beclin 1介導(dǎo)饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[6, 10]，并有抑制饑餓誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡的作用[5]。腫瘤生長(zhǎng)過(guò)快會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺乏的狀態(tài)，探索饑餓狀態(tài)下肝癌細(xì)胞抗凋亡的機(jī)制對(duì)抗腫瘤有幫助。bax基因是一種促凋亡基因，bax變化與凋亡水平相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著HepG2細(xì)胞饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，bax蛋白表達(dá)量與NS5ATP9均有升高趨勢(shì)。前期研究結(jié)果已明確NS5ATP9在饑餓時(shí)的表達(dá)增加對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡有抑制作用[5]。本研究結(jié)果顯示在饑餓HepG2細(xì)胞的同時(shí)抑制NS5ATP9的表達(dá)，再次檢測(cè)bax的蛋白表達(dá)升高，caspas3/7活性也相應(yīng)增強(qiáng)，證實(shí)在饑餓狀態(tài)下NS5ATP9的高表達(dá)會(huì)下調(diào)bax的表達(dá)。

Beclin 1 在不同腫瘤中的作用并不一致，有研究應(yīng)用肝癌組織基因芯片，發(fā)現(xiàn)Beclin 1 mRNA在肝腫瘤組織和肝癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正常肝組織及肝細(xì)胞[14]。本研究在抑制Beclin 1表達(dá)后再次檢測(cè)NS5ATP9對(duì)HepG2細(xì)胞caspas3/7活性和bax表達(dá)的影響，結(jié)果顯示caspas3/7活性增強(qiáng)，并且bax表達(dá)增加。然而抑制Beclin 1并沒(méi)有完全阻抑NS5ATP9對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的抑制作用，推測(cè)Beclin 1部分參與了NS5ATP9對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的抑制作用。Beclin 1在抗肝癌的研究中也是熱點(diǎn)基因[15]，褪黑素可通過(guò)抑制PERK-ATF4-Beclin 1抑制自噬，增強(qiáng)肝癌對(duì)索拉非尼的敏感性[7]。另有研究顯示，F(xiàn)TY720(抗腫瘤藥物)與si-Beclin 1共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，肝癌細(xì)胞對(duì)FTY720的敏感性增加[8]。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin 1在NS5ATP9抑制饑餓誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中所起的作用，為未來(lái)Beclin 1作為靶點(diǎn)基因在抗肝癌藥物中的應(yīng)用提供參考價(jià)值。