王冰，呂艷玲

寶雞市人民醫(yī)院麻醉科，陜西 寶雞 721000

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，手術仍是其最主要治療方式，隨著新輔助放化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療手段的發(fā)展，直腸癌患者的術后生活質量和預后得到改善[1-2]。研究表明，麻醉藥也是影響腫瘤患者預后的因素之一[3]。鹽酸右美托咪定為腎上腺素受體激動劑，常用于麻醉時輔助鎮(zhèn)靜。有研究報道右美托咪定可改善機體免疫功能，減輕直腸癌患者行腹腔鏡手術時圍術期應激反應[4]。右美托咪定可顯著降低腹腔鏡直腸癌根治術患者的血清炎性因子水平，提高患者的肺功能，促進臨床療效[5]。此外，右美托咪定還有抗腫瘤作用，如右美托咪定通過miR-760/HDGF 信號通路減弱膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力，促進細胞凋亡[6]。右美托咪定還可通過上調miR-196a-5p表達促進結直腸癌LOVO細胞侵襲和遷移[7]。然而右美托咪定對直腸癌細胞增殖和凋亡的影響及機制尚不清楚。

有研究表明circRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預后密切相關，在腫瘤早篩查腫瘤治療等領域具有巨大潛力[8]，circ_0072995 在乳腺癌組織和細胞系中上調，沉默_0072995可抑制乳腺癌腫瘤生長[9]，circ_0072995通過調節(jié)miR-147a/CDK6 軸促進上皮性卵巢癌的進展[10]。然而circ_0072995 對直腸癌的影響以及右美托咪定對其影響尚不清楚。因此，本研究主要探討右美托咪定是否可通過調節(jié)circ_0072995表達而影響直腸癌細胞生物學行為。

1 材料與方法

1.1 臨床材料 選取寶雞市人民醫(yī)院2017 年1月至2021年1月收治的88例直腸癌患者的癌組織及癌旁組織標本，手術前未進行放化療，所有患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 SW480 細胞(美國ATCC)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR 試劑盒(大連寶生物)；右美托咪定(深圳海思安生物技術有限公司)；MTT 試劑盒、凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶)。si-circ_0072995、si-NC、pcDNA-circ_0072995和pcDNA載體質粒(廣州銳博生物公司)。

1.3 細胞處理與分組 將1 mg 右美托咪定用210 mL 的0.9%氯化鈉溶液稀釋至濃度為10 μmol/L，然后再將10 μmol/L的右美托咪定分別用培養(yǎng)液稀釋成濃度為1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L，然后處理SW480細胞，記為Dex 1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 組，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基中的SW480 細胞記為con組；將circ_0072995 干擾表達載體及陰性對照轉染至SW480 細胞，記為 si-circ_0072995 組、si-NC 組；將circ_0072995過表達載體及陰性對照轉染至SW480細胞后用5 μmol/L 右美托咪定處理，記為Dex+pcDNA-circ_0072995 組 、Dex+pcDNA 組 。 其 中 si-circ_0072995 序列為：5'-ACCTCAATCGCCGGG-3'，si-NC序列為：5'-TGGAGTTAGCGGCCC-3'。

1.4 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測circ_0072995 的表達水平 提取組織及各組細胞的總RNA，合成cDNA 后進行PCR，相對表達量用2-ccCt法計算。以GAPDH為內參，circ_0072995上游引物序列：5'-CAGGCCAGAGGAAAGAACAG-3'，下游引物序列：5'-CAGCGCCCCATCTCATAGCCA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGCTGAGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.5 MTT 檢測細胞增殖抑制率 將各組細胞以5×103個/孔的密度細胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后通過MTT測定評估細胞增殖抑制率。

1.6 克隆形成實驗檢測克隆形成數(shù) 將各組細胞以每孔100 個細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)2 周，甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h 后用預冷的 PBS 漂洗 2 次，與 500 μL 的結合緩沖液混勻；加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circ_0072995在直腸癌患者中的表達及其與臨床病理關系 腸癌組織中circ_0072995表達水平為2.36±0.15，明顯高于癌旁組織的1.00±0.02，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1；circ_0072995表達水平與患者年齡無關，與TNM 分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1。

圖1 直腸癌組織中circ_0072995表達水平

表1 circ_0072995的表達與臨床病理關系(例)

2.2 右美托咪定對SW480 細胞增殖和凋亡的影響 與con 組比較，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L組SW480 細胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、圖3和表2。

表2 右美托咪定對SW480細胞增殖、凋亡的影響(，n=9)

表2 右美托咪定對SW480細胞增殖、凋亡的影響(，n=9)

注：與con 組比較，aP<0.05；與Dex 1 μmol/L 組比較，bP<0.05；與 Dex 2 μmol/L 組比較，cP<0.05。

組別Con組Dex 1 μmol/L組Dex 2 μmol/L組Dex 5 μmol/L組F值P值抑制率(%)0.00±0.00 16.73±1.38a 29.96±2.62ab 46.14±3.71abc 613.278<0.05凋亡率(%)7.84±0.50 14.95±0.75a 19.38±1.19ab 22.16±3.78abc 85.026<0.05克隆形成數(shù)(個)119.56±7.32 93.56±4.19a 73.00±3.94ab 51.33±2.87abc 321.653<0.05

圖2 右美托咪定對SW480細胞凋亡的影響

圖3 右美托咪定對SW480細胞克隆形成的影響

2.3 右美托咪定對SW480 細胞中circ_0072995表達的影響 與con 組比較，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 組 SW480 細胞中 circ_0072995 表達水平降低，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 右美托咪定對SW480 細胞中circ_0072995 表達水平的影響(，n=9)

表3 右美托咪定對SW480 細胞中circ_0072995 表達水平的影響(，n=9)

注：與 con 組比較，aP<0.05；與 Dex 1 μmol/L 組比較，bP<0.05；與 Dex 2 μmol/L 組比較，cP<0.05。

組別Con組Dex 1 μmol/L組Dex 2 μmol/L組Dex 5 μmol/L組F值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.47±0.03ab 0.23±0.02abc 1 024.615<0.05

2.4 沉默circ_0072995 對SW480 細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-circ_0072995 組circ_0072995 表達水平降低，細胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4、圖5和表4。

圖4 沉默circ_0072995對SW480細胞凋亡的影響

圖5 沉默circ_0072995對SW480細胞克隆形成的影響

表4 沉默circ_0072995 對SW480 細胞中circ_0072995 表達、增殖和凋亡的影響(，n=9)

表4 沉默circ_0072995 對SW480 細胞中circ_0072995 表達、增殖和凋亡的影響(，n=9)

組s別i-NC組si-circ_0072995組t值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.28±0.03 72.000<0.05抑制率(%)0.00±0.00 36.76±2.02 54.594<0.05凋亡率(%)7.91±0.61 20.41±1.21 27.674<0.05克隆形成數(shù)(個)117.00±8.41 63.78±2.39 18.261<0.05

2.5 circ_0072995 對右美托咪定處理的SW480細胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA 組比較，Dex+pcDNA-circ_0072995 組 circ_0072995 表 達 水 平升高，細胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6、圖7 和表5。

圖6 circ_0072995對右美托咪定處理的SW480細胞凋亡的影響

圖7 circ_0072995對右美托咪定處理的SW480細胞克隆形成的影響

表5 circ_0072995減弱右美托咪定對SW480細胞circ_0072995表達、增殖、凋亡的作用(，n=9)

表5 circ_0072995減弱右美托咪定對SW480細胞circ_0072995表達、增殖、凋亡的作用(，n=9)

組別Dex+pcDNA組Dex+pcDNA-circ_0072995組t值P值circ_0072995 1.00±0.00 3.57±0.15 51.400<0.05抑制率(%)46.23±3.27 13.75±0.81 28.033<0.05凋亡率(%)22.07±1.35 10.13±0.81 22.752<0.05克隆形成數(shù)(個)49.89±3.14 104.22±5.12 27.137<0.05

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥能影響患者免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細胞的活性，從而影響腫瘤的進展[11-12]。研究報道右美托咪定通過miR-143-3p/EPS8 軸抑制食管癌的進展[13]。右美托咪定可以通過上調miR-185表達和滅活SOX9/Wnt/β-catenin 信號通路來抑制卵巢癌的發(fā)展[14]。右美托咪定通過下調miR-1307 表達抑制骨肉瘤細胞生物學行為[15]。以上研究均表明臨床常用麻醉藥右美托咪定可參與調控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。為研究右美托咪定對直腸癌的影響，本實驗用不同濃度右美托咪定處理SW480 細胞，結果顯示，SW480細胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，呈濃度依賴性；表明右美托咪定可抑制SW480 細胞增殖，促進細胞凋亡，提示右美托咪定在直腸癌中可能也起抑癌作用。

研究報道circ_0072995 通過miR-30c-2-3p 促進乳腺癌細胞遷移和侵襲[16]。circ_0072995 通過調節(jié)miR-122-5p/SLC1A5 軸促進卵巢癌進展[17]。敲低circ_0072995 可通過調控miR-1253/EIF4A3 信號抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲[18]。本實驗結果顯示，腸癌組織中circ_0072995 表達水平升高，且circ_0072995表達水平與TNM 分期及淋巴結轉移相關，提示circ_0072995 可能在直腸癌中起促癌基因作用，且影響患者的病理分期及轉移。進一步沉默circ_0072995 后，SW480細胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少；表明沉默circ_0072995 可抑制SW480 細胞增殖，促進細胞凋亡。為研究直腸癌中右美托咪定與circ_0072995 的關系，本實驗檢測了右美托咪定處理后SW480 細胞中circ_0072995 的表達水平，結果顯示，circ_0072995 的表達水平降低，表明右美托咪定可抑制circ_0072995 的表達；而circ_0072995過表達的同時用右美托咪定處理，結果發(fā)現(xiàn)，細胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成數(shù)增加，表明circ_0072995過表達可減弱右美托咪定對SW480細胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，右美托咪定可能通過下調circ_0072995抑制直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡。