曹國梅 張陸巖 黃春紅 朱子成

1 寧波明州醫(yī)院檢驗科，浙江省寧波市 315000； 2 北京博奧生物技術有限公司； 3 廈門致善生物科技股份有限公司

聽力障礙是我國第二大出生缺陷疾病[1]。耳聾對嬰幼兒的語言發(fā)育造成嚴重影響，并對患兒的家庭造成巨大的經(jīng)濟和精神負擔。目前認為，嬰幼兒出現(xiàn)聽力障礙主要與環(huán)境因素、遺傳因素有關。聽力篩查是既往發(fā)現(xiàn)新生兒聽力障礙的重要方式，自2003年開始，我國開始對新生兒開展聽力障礙的篩查工作，新生兒出生3d內一般會安排1次常規(guī)聽力篩查，對篩查未通過的新生兒，需在42d內進行復篩。隨著相關研究的逐步深入，常規(guī)篩查方式對新生兒聽力障礙的篩查缺陷逐漸顯現(xiàn)，即不能及時發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾患兒。

臨床資料顯示，部分未通過聽力篩查(初篩)的患兒需要在數(shù)月后經(jīng)過診斷性檢查才能確診，而部分遲發(fā)性患兒在2～3歲時才會表現(xiàn)出明顯的聽力障礙。與常規(guī)篩查策略相比，耳聾基因篩查的準確率更高，將兩種方法進行結合使用，能夠將新生兒聽力障礙的確診時間提前至7～14d，同時排除其他因素對篩查結果的干擾作用[2]。本文圍繞新生兒耳聾的基因篩查方法展開分析，重點比較熒光PCR熔解曲線法、微陣列芯片法在新生兒耳聾基因篩查中的表現(xiàn)，探討兩種篩查方法是否能夠滿足臨床篩查的需要，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 篩查對象 選取2019年7月—2021年1月本院產科病房出生的20例新生兒(3d內)，采集20例干血斑樣本，其臨床結果已知。分別使用微陣列芯片法、熒光PCR熔解曲線法進行篩查。新生兒家長知情同意并簽署同意書。

1.2 試劑盒與儀器 (1)微陣列芯片法：選用十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒(微陣列芯片法，試劑批號：20190603，生產廠家：北京博奧晶典生物技術有限公司)，其他主要儀器有晶芯SlideWasher洗干儀(生產廠家：博奧生物集團有限公司)、LuxScan 10K/B晶芯微陣列芯片掃描儀(生產廠家：博奧生物集團有限公司)、S1000 PCR儀(生產廠家：BioRad)。樣本處理與檢測方法參考試劑盒的標準操作規(guī)程，結果由分析系統(tǒng)自動判讀。若探針監(jiān)測信號值≥探針cut off 值，結果為陽性；反之，結果為陰性。(2)熒光PCR熔解曲線法：選用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(PCR熔解曲線法，試劑批號：210051001，生產廠家：廈門致善生物科技股份有限公司)，其他儀器主要有SLAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)。樣本的處理與檢測方法參考試劑盒的操作規(guī)程，結果由分析系統(tǒng)給出。

1.3 方法 本次對比試驗的主要目的是驗證基因篩查方法的準確性、重復性以及檢出限。具體驗證方案如下。準確度驗證：利用試劑盒對20例干血斑樣本進行檢測，并將實驗室檢測結果與臨床結果進行對比。重復性驗證：選取2例樣本，對樣本進行3次重復檢測，對比檢測結果與預期結果。檢出限驗證：根據(jù)試劑盒說明書要求的被檢DNA濃度下限，選取1例結果已知的干血斑樣本并提取核酸，對核酸濃度進行測定，將其稀釋到3～25ng/μl水平，并進行靈敏度驗證。

2 結果

2.1 準確度驗證 微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法的檢測結果基本一致，20例樣本中有8例陽性樣本，12例野生型樣本。實驗室檢測結果與臨床已知結果一致，微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法的準確率為100%，詳見表1。

表1 兩種檢測方法的準確度驗證結果

2.2 重復性驗證 微陣列芯片法結果顯示，重復3次檢測的結果一致，與臨床已知結果相吻合。詳見表2。熒光PCR熔解曲線法的重復性驗證結果顯示，4例樣本每個通道Tm值的變異系數(shù)(CV)均≤5%，符合驗證要求。詳見圖1。

表2 微陣列芯片法的重復性驗證結果

2.3 檢出限驗證 微陣列芯片法結果顯示，在核酸濃度降低至檢測下限后，該試劑盒仍然能夠準確地檢測出突變位點，其結果如表3所示。熒光PCR熔解曲線法結果顯示，稀釋至檢出限下限后試劑盒仍然能夠準確地檢測出檢出限樣本，其驗證結果如表4所示。

表3 微陣列芯片法靈敏度驗證結果

表4 熒光PCR熔解曲線法的檢出限驗證結果

3 討論

基因篩查是利用現(xiàn)有醫(yī)學檢測手段對受檢者的遺傳信息進行檢測，從中發(fā)現(xiàn)目標改變的過程，篩查結果對個體患病風險的判斷以及用藥治療等有重要的參考價值。針對新生兒耳聾，通過現(xiàn)有的基因檢測方法對遺傳性耳聾相關的基因位點進行檢測，能夠準確判斷新生兒的耳聾風險或聽力障礙的病因，從而積極采取干預措施?；仡櫺苑治鲂律鷥憾@基因的篩查結果，新生兒耳聾主要與GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體12SrRNA基因、GJB3基因有關[3-7]。新生兒耳聾基因的篩查有多種檢測方法，不同檢測方法的檢測原理、適用條件、檢測效果以及檢測過程所需的儀器、設備等存在差異，而早期篩查工作的開展由于缺乏統(tǒng)一的標準，以及檢測過程中的不當操作，基因檢測的結果難以獲得有效的保障。目前認為，遺傳性耳聾基因篩查的局限性主要表現(xiàn)在檢測技術、檢驗范圍以及結果解讀等方面[8]。在對基因檢測過程進行嚴格質量控制并完善檢測過程管理體系的情況下，現(xiàn)有的基因變異篩查方法仍然不能完全避免假陰性、假陽性結果的出現(xiàn)，為此，在出現(xiàn)爭議結果時，需要有兩種不同的技術檢驗方案進行驗證。

在現(xiàn)有的檢測方法中，微陣列芯片法是比較主流的篩查技術，羅會濤等[9]利用微陣列芯片法對新生兒進行上述四個基因的15個突變位點進行檢測，并就該方法對先天性耳聾基因的篩查價值進行了論證。本文選取15項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒，對其檢測性能進行驗證。從原理層面看，此類試劑盒的模板為人基因組DNA，檢測對象為遺傳性耳聾相關基因的15個突變位點，檢測時由帶有Tag標簽序列的基因位點特異性引物實現(xiàn)檢測對象的擴增、熒光及生物素標記，之后進行磁分離、堿變性，通過與通用基因芯片的雜交與掃描分析，得到15個突變位點的檢測結果。在檢測過程中，本方法對樣本有一定的要求：(1)上游標本為人全血時，抗凝劑不得使用肝素，檢測結果不受受檢者個體的飲食、服用狀況等因素的影響；(2)上游標本為人濾紙干血斑時，檢測人員需要對采血過程、樣本的管理等進行嚴格管理。為了解該試劑盒的檢測性能，本次試驗選取了20例臨床結果已知的干血斑樣本，樣本采集過程和檢驗過程均參考實驗室管理規(guī)范以及試劑盒操作規(guī)程，并采取不同的方式對20例樣本進行檢測，以驗證試劑盒的準確度、重復性以及檢出限。對比臨床檢測結果與試劑盒檢測數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)，20例樣本檢測結果的準確率為100%，2例樣本重復3次檢驗的結果均與臨床已知結果相符，樣本稀釋至檢測下限后，試劑盒仍能夠準確地檢測出突變位點。而從基因檢測的實現(xiàn)過程來看，該方法需要將一定數(shù)目的DNA探針進行固定，檢測類型有限，檢測項目未涵蓋所有與新生兒耳聾相關的全部基因與突變位點，不能有效地檢測出突變率較低的基因類型與突變位點。

熒光PCR熔解曲線法主要通過熒光標記探針與PCR產物形成的雙鏈雜交體的溶解曲線分析掌握樣本基因情況[10-11]。在用于遺傳性耳聾基因檢測的檢測時，本方法需要用引物擴增人的4個常見耳聾基因，然后對雙鏈雜交體進行溶解曲線分析，根據(jù)分析結果對受檢者4個常見耳聾基因是否有突變以及具體的突變類型進行判讀。此次試驗所用的試劑盒由廈門致善生物科技股份有限公司生產，配套全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，每份樣本需要在4個PCR反應體系內完成檢測，對應擴增試劑中的耳聾PCR反應管。驗證其性能時，對20例臨床樣本進行檢測，結果顯示，檢測結果與臨床已知結果完全吻合，準確率100%。重復性驗證發(fā)現(xiàn)，4例樣本每個通道Tm值的變異系數(shù)(CV)均≤5%，符合驗證要求。驗證樣本稀釋后試劑盒檢測的準確性，結果表明，稀釋至檢出限下限后試劑盒仍然能夠準確地檢測出檢出限樣本。因此，熒光PCR熔解曲線法能夠滿足新生兒耳聾基因的臨床篩查需求。臨床適用性方面，熒光PCR熔解曲線法避免了煩瑣的檢測程序以及高額的篩查成本，具備在新生兒聽力障礙臨床篩查工作中大規(guī)模應用的可能性[12-13]；利用試劑盒進行常見基因的突變位點篩查，檢測過程的歷時較短，檢測位點的選擇相對靈活，能夠根據(jù)受檢者的實際情況制定個性化的檢測方法[14-15]。本次研究結果提示，上述兩種方法對新生兒耳聾基因的篩查有明確的診斷價值，能夠為臨床篩查工作提供可靠的參考信息，在考慮有假陰性、假陽性等情況時，或者篩查過程中出現(xiàn)爭議時，可同時應用兩種方法進行基因檢測，互為驗證。

綜上所述，微陣列芯片法與熒光PCR熔解曲線法對新生兒耳聾基因的篩查有顯著的臨床價值，相關試劑盒在檢驗過程中的準確性、重復性以及檢出限驗證結果均通過，提示兩種方法均可用于臨床篩查。但臨床實踐中，兩類試劑盒涉及的方法學、檢驗原理與檢測過程存在一定的差異，可根據(jù)實際篩查需求合理選取篩查方法。