沈婷婷 劉瑾 徐光臨 蔣潔瑩

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

天參利咽顆粒是我院根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)處方研制的中藥復(fù)方制劑，由南沙參、北沙參、天花粉、生白芍、百合、甘草等8味中藥組成，具有清肺養(yǎng)陰，養(yǎng)胃生津，利咽喉的功效，主要用于慢性咽炎的治療。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項(xiàng)目較少，主要為顆粒劑的常規(guī)檢查項(xiàng)，而對中藥成分的定性定量控制較欠缺，為能更全面有效地控制制劑質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)選取處方中的生白芍、南沙參和甘草進(jìn)行薄層鑒別，并對生白芍中的有效成分芍藥苷進(jìn)行含量測定的研究，試驗(yàn)結(jié)果表明采用的方法操作簡便，靈敏度高、重復(fù)性好，可用于完善天參利咽顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SK7200B低頻率臺面式超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；AUY220電子分析天平(日本島津公司)；TG332A十萬分之一微量分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，20g)；DHG-9140A型電加熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HH-ZKS4恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療硅膠器械有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠，10 cm×10 cm)；定量毛細(xì)管(4 μL)。

1.2試藥 天參利咽顆粒(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室，批號20190201、20190455、20190638、20190819)；天參利咽顆粒陰性樣品(制劑室自制小樣)；南沙參藥材(上海虹橋中藥飲片有限公司，批號：20190428)；甘草對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：0904-9605)；芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201539，含量96.4%)；水為純化水，甲醇、磷酸和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC色譜鑒別

2.1.1生白芍TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各2 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加乙醇40 mL，超聲處理(頻率35 kHz，功率350 W)30 min，濾過，置水浴上蒸干，殘?jiān)尤? mL乙醇使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加入乙醇制備成1 mg·mL-1的對照品溶液。再取自制處方中缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法[1]，分別吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各16 μL，對照品溶液4 μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，在三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出，晾干，使用2%的香草醛硫酸溶液將薄層板浸潤，取出，放置約3 min至斑點(diǎn)逐漸顯色清晰。結(jié)果見圖1，供試品溶液在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)，陰性對照溶液在此位置無斑點(diǎn)干擾。

1-3.供試品溶液; 4.芍藥苷對照品溶液;5.陰性對照溶液

2.1.2南沙參TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各10 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，經(jīng)1 h加熱回流后，放置冷卻，濾過，濾液置水浴蒸干，得到的殘?jiān)褂? mL的乙醇溶解，作為供試品溶液。另取南沙參藥材粉碎成粉末，稱取2 g，用同樣的方法制得對照藥材溶液。再取自制的處方中缺南沙參的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液，參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法，分別吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各4 μL，對照藥材溶液12 μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，在二氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶0.5∶0.1 mL)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出后晾干，再使用2%的香草醛硫酸溶液將薄層板浸濕，放置約3 min至斑點(diǎn)逐漸顯色清晰。結(jié)果見圖2，供試品溶液在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色斑點(diǎn)，陰性對照溶液在此位置無斑點(diǎn)干擾。

2.1.3甘草TLC鑒別 分別稱取天參利咽顆粒三批各10 g，置研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，經(jīng)過1 h的加熱回流，放置冷卻后，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并得到正丁醇液，用水洗滌2次，水液棄去，正丁醇液蒸干，在殘?jiān)屑尤? mL乙醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1g，用相同的方法制得對照藥材溶液。再取自制處方中缺甘草的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。參照2020年版《中華人民共和國藥典》，四部通則0502收載的薄層色譜法，分別吸取以上的三種溶液各4 μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，在乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑的展開缸預(yù)飽和15 min后，上行展開，取出，晾干，再使用10%的硫酸乙醇溶液將薄層板浸濕，105℃加熱至斑點(diǎn)逐漸顯色清晰。如圖3所示，供試品溶液在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置，顯相同的黃色斑點(diǎn)，陰性對照溶液在此位置無斑點(diǎn)干擾。

1-3.供試品溶液;4.南沙參對照藥材溶液;5.陰性對照溶液

1-3.供試品溶液;4.甘草對照藥材溶液;5.陰性對照溶液

2.2芍藥苷的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(2) 5 μm，200×4.6 mm，流動相配比為乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)，設(shè)定柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，進(jìn)樣量為10 μL，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于2000。

2.2.2各溶液的制備 ① 對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度為120 μg·mL-1的溶液，備用。

② 供試品溶液的制備：取天參利咽顆粒適量，研成細(xì)粉后取1 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入50%的乙醇35 mL，超聲處理30 min，冷卻后再加入50%的乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

③ 陰性對照溶液的制備：取自制處方中缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液，備用。

2.2.3專屬性實(shí)驗(yàn)[2]取以上對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，照“2.2.1”項(xiàng)建立的色譜條件分別進(jìn)樣檢測，觀察結(jié)果。結(jié)果供試品溶液中被測組分的保留時(shí)間與芍藥苷對照品的保留時(shí)間一致，且與相鄰峰分離度好，陰性對照溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)無吸收峰，對被測組分未產(chǎn)生干擾，所建立的方法專屬性強(qiáng)。(圖4-a、圖4-b、圖4-c)

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系考察 取芍藥苷對照品適量，用微量分析天平精密稱定，加甲醇溶解，制成246 μg·mL-1的濃溶液，分別精密吸取該濃溶液1、3、5、6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到芍藥苷對照品溶液的濃度分別為24.6，73.8，123.0，147.6 μg·mL-1，和濃溶液一起按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣10 μL，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，芍藥苷對照品溶液濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為：Y=13.521X+7.4313，r=0.9999，如圖5所示：結(jié)果表明，芍藥苷在24.6～246.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取123.0 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得芍藥苷峰面積的RSD值為1.86%，表明所使用的儀器具有較好的精密度。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[3-4]取同一份供試品溶液，分別于常溫下放置0、2、4、8、12 h后取樣，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得芍藥苷峰面積的RSD值為1.79%.結(jié)果表明樣品常溫放置，12 h之內(nèi)，較為穩(wěn)定。

圖4 HPLC色譜圖

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)[5]取同一批樣品(批號20190638)，照“2.2.2”②項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算每份樣品的芍藥苷含量，得芍藥苷的平均含量為4.45 mg·g-1，RSD為2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收實(shí)驗(yàn)[6]取已知芍藥苷含量為4.45 mg·g-1的同一批樣品(批號20190638)6份，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品適量，照“2.2.2”②項(xiàng)下方法處理后，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算，結(jié)果得芍藥苷的平均回收率為100.05%，RSD為2.03%(見表1)。

表1 芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9樣品含量測定 取不同批次的4批樣品，照“2.2.2”②項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算芍藥苷的含量。(見表2)

表2 4批樣品芍藥苷含量測定結(jié)果

3 討論

天參利咽顆粒源于已故全國名老中醫(yī)張贊臣的“養(yǎng)陰利咽湯”經(jīng)驗(yàn)方，多年的臨床實(shí)踐證明，天參利咽顆粒對于慢性咽炎具有很好的療效[7]。方中南沙參為君藥，具有滋養(yǎng)肺胃,養(yǎng)陰生津的功效。甘草具有瀉火解毒利咽的功效，為方中的臣藥。白芍生用是此方較于經(jīng)驗(yàn)方“養(yǎng)陰利咽湯”一大改進(jìn)的地方，其味苦酸與方中其它甘潤之品相配，可增加斂陰生津之力[8]。根據(jù)在處方中的功效及用量，選取此三味代表性的中藥進(jìn)行薄層色譜鑒別和含量測定的研究。

3.1薄層鑒別 實(shí)驗(yàn)中，曾嘗試分別采用二氯甲烷和正己烷超聲處理樣品，欲提取制劑中南沙參的化學(xué)成分蒲公英萜酮作定性鑒別項(xiàng)，結(jié)果斑點(diǎn)均未能在薄層板呈現(xiàn)，分析原因可能為該成分在制劑生產(chǎn)過程中已被破壞，于是參考馬燕等[9]對南沙參薄層鑒別的研究資料，以南沙參對照藥材為參照，改變供試品的提取方式和展開劑，結(jié)果較為滿意。在顯色時(shí)，由于2%香草醛硫酸溶液粘度較大，不易噴霧，故改為浸漬顯色，不僅可以使薄層板各部位均勻地接觸顯色劑，也減少了環(huán)境污染。浸板時(shí)間不宜長，要頃刻取出，放置片刻即可顯現(xiàn)斑點(diǎn)，加熱易使薄層板碳化[10]，斑點(diǎn)擴(kuò)散模糊，后面生白芍的薄層顯色亦是如此。另外對藥典收載的甘草薄層鑒別法進(jìn)行借鑒和調(diào)整[11-12]，為避免使用有毒易燃的試劑，供試品處理則去掉乙醚加熱回流這一步。文中所建立TLC定性鑒別方法操作簡便，特征斑點(diǎn)明顯，且Rf值適中，陰性對照均無干擾。

3.2方法學(xué)考察 生白芍所占處方比例量大，且芍藥苷含量較高，測定方法成熟[13-14]，靈敏度高，可作為該制劑含量測定的指標(biāo)成分，流動相及檢測波長經(jīng)查閱藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]優(yōu)選確定，建立該制劑的高效液相含量測定方法，其儀器的精密度、操作重復(fù)性、樣品的穩(wěn)定性均符合要求，芍藥苷主峰分離度較好。在確定含量測定項(xiàng)中的供試樣品溶液配制方法前，分別使用50%乙醇和 70%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果 50%乙醇提取效率稍高，同時(shí)又對加熱回流和超聲兩種提取方式進(jìn)行比較，測定結(jié)果差異不大，綜合考慮超聲提取操作簡便，不容易破壞有效成分，故選擇此制備方法。本研究中，4批天參利咽顆粒的芍藥苷含量差異明顯，分析原因可能為所用的中藥材質(zhì)量差異或制劑過程中的人為操作因素所致[17]，今后將更加規(guī)范操作,從固定的供貨商處采購來源、炮制方式相同的飲片進(jìn)行投料，并通過制訂含量限度控制制劑的質(zhì)量，由于4批樣品芍藥苷的平均含量為4.13 mg·g-1，其均值的80%為3.304 mg·g-1，故擬定天參利咽顆粒的含量限度為每1 g含生白芍(以芍藥苷C23H28O11計(jì))不得少于3.3 mg[18-20]。

由于中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制復(fù)雜，受時(shí)間和條件的限制，本文只對以上幾味中藥進(jìn)行了相關(guān)的研究，今后還將繼續(xù)進(jìn)一步研究。考慮到該制劑的生產(chǎn)工藝為中藥飲片煎煮濃縮而成，并無生藥粉直接投料使用，顯微鑒別中藥成分較為困難，所以后續(xù)的研究仍將以增加定性鑒別項(xiàng)目和定量測定項(xiàng)目為方向，使該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂能夠更加完善使其質(zhì)量得到全面有效的控制。