胡倩 李麗梅 王興強 王為 張春燕 湯小虎,**

(1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，并與人類白細胞抗原B27(HLA-B27)密切相關(guān)的全身性、慢性炎癥性疾病，影響著全球近0.1～0.5%的人口，由其引發(fā)的相關(guān)疼痛癥狀及韌帶骨化造成不可逆的功能障礙嚴重影響患者的工作和生活[1-2]。

目前西醫(yī)治療以減少炎癥反應、防止或降低結(jié)構(gòu)破壞，改善功能為主[3]。臨床上使用非甾體抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等治療，雖取得一定的療效，其胃腸道反應和潛在的毒副作用亦不容忽視，影響患者長期用藥[4]。中醫(yī)藥以其獨特的療效，在減輕疼痛、調(diào)節(jié)免疫、改善機體整體狀況等方面對AS有著積極的治療作用。

中醫(yī)歷代文獻并無“強直性脊柱炎”的病名，但根據(jù)類似AS的臨床癥狀、晚期表現(xiàn)為駝背畸形等特點，大部分醫(yī)家將AS冠以“痹證”“大僂”等名稱，認為腎陽、督脈虧虛，外邪痹阻經(jīng)絡(luò)為其主要病因病機[5]。但不乏有醫(yī)家主張肝血不足，筋脈失其濡養(yǎng)、以致拘攣疼痛，在治療上強調(diào)舒筋通絡(luò)、解痙止痛[6]。

白芍-甘草是中醫(yī)緩急止痛的經(jīng)典配伍，最早見于張仲景《傷寒雜病論》[7]芍藥甘草湯，第26條：“傷寒脈浮，自汗出，小便數(shù)，心煩，微惡寒，腳攣急……更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸。”該方藥簡力專由白芍和炙甘草構(gòu)成，白芍酸苦微寒，益陰養(yǎng)血；炙甘草甘溫，補中緩急。二藥合用酸甘化陰，有滋陰養(yǎng)血、緩攣急、止疼痛的作用[8]?，F(xiàn)代研究和臨床實踐也證實，芍藥甘草湯具有顯著的解痙[9]、抗炎[10]、鎮(zhèn)痛[11]、保護跟腱組織[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等作用，對多種痙攣、疼痛、炎癥性疾病等都有顯著的治療作用[14]。在臨床研究中含有白芍-甘草藥對的烏頭湯、獨活寄生湯等在治療AS上取得了較好的療效[15-16]。但目前對白芍-甘草治療AS的有效作用是基于哪些主要成分及分子作用機制尚未見系統(tǒng)描述。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于人工智能和大數(shù)據(jù)時代藥物系統(tǒng)性研究的新興、交叉、前沿學科，其具有的整體性、系統(tǒng)性和綜合性的特點與中藥的多成分、多靶點、整體性高度相似，近年來運用網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中藥作用的分子機制已經(jīng)成為常用手段，為中藥復雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的科技支撐[17-18]。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法探尋白芍-甘草治療AS可能的作用靶點及其作用機制，以期為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物化學成分及其相關(guān)靶點的獲取 基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，分別檢索白芍和甘草的所有活性成分，并根據(jù)中藥成分的 ADME(藥代動力學)，設(shè)置過濾條件[19]：具有較高口服生物利用度即OB (Oral bioavailability)>30% 的分子和具有較好的類藥性即DL(Drug-likeness) >0.18 的分子。并在“Related Targets”欄目檢索并篩選白芍和甘草有效活性成分的作用靶點。

1.2AS疾病靶點及其與藥物交集靶點的獲取 通過人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、治療靶標數(shù)據(jù)庫(TTD)、DrugBank數(shù)據(jù)庫，遺傳藥理學與藥物基因組學數(shù)據(jù)庫(PharmGKb)，以“Ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞搜集疾病靶點。得到疾病相關(guān)的基因信息并刪除重復的靶點。將藥物和疾病靶點經(jīng)過Uniport數(shù)據(jù)庫標準化，統(tǒng)一為蛋白質(zhì)ID格式后將其進行對比匹配，獲得與白芍-甘草治療AS疾病相關(guān)的潛在作用靶點。

1.3核心靶點圖的構(gòu)建 將化合物和疾病的共同靶點導入STRING 11.0 在線平臺(https://string-db.org)，設(shè)置物種為人類(“Homo sapiens”)，最小交互值(“minimum required interaction score”) > 0.700。得到核心靶點數(shù)據(jù)、導出為TSV格式，并利用R軟件繪制條形圖，進行結(jié)果的可視化。

1.4GO生物功能及KEGG信號通路富集分析 運用Bioconductor平臺和R語言，對得到的藥物-疾病共同靶點進行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，說明其在基因功能中的作用，并將其結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1白芍-甘草化合物及其相關(guān)靶點 初步篩選出藥物已知成分共365種，其中通過過濾條件，計105個，其中白芍13 個，甘草 92 個。整合TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測，以及通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫標準化，刪除重復值后共獲得 214 個化合物相關(guān)潛在靶點。

2.2疾病靶點搜索結(jié)果 共獲得疾病靶點2519個，其中TTD數(shù)據(jù)庫11個，PharmGKb數(shù)據(jù)庫3個，OMIM數(shù)據(jù)庫103個，GeneCards數(shù)據(jù)庫2011個，DrugBank數(shù)據(jù)庫391，刪除重復值，最終獲得AS疾病靶點共2137個。與白芍-甘草藥物活性成分潛在靶點對比匹配，共獲得TNF、IL6、CD14、PTGS1、PTGS2等80個交集靶點，韋恩圖(見圖1)。通過與白芍-甘草105個活性成分匹配后，得到87個具有治療AS作用的活性成分。

圖1 交集靶點

2.3中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將87個活性成分及80個交集靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，具體見圖2，圖中紅色為白芍的化合物，綠色為甘草的化合物，黃色為靶點，并對該網(wǎng)絡(luò)圖中的化合物節(jié)點的度值(Degree)進行分析，Degree在活性成分節(jié)點表示該活性成分所對應的靶點個數(shù)，意味著度值越大，該活性成分在治療AS的過程中所發(fā)揮的作用也越大，可得出前5位關(guān)鍵化合物為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、鉤藤酮a(licochalcone a)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)分別能與55、23、19、15、12個關(guān)鍵靶點連接，對治療AS具有重要的意義，具體見表1，選取度值 > 10的活性成分進行展示。

圖2 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 “白芍-甘草”治療AS的主要活性成分

2.4核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將80個共同靶基因?qū)胫罶TRING，利用R軟件繪制條形圖，展示Degree排名前30的靶點，見圖3，其中Degree值較高的為核心基因，由圖可見白細胞介素-6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶-3(MAPK3)、白細胞介素1B(IL-1B)等基因排名靠前，其中TNF(Degree54)和IL6(Degree59)和為白芍-甘草治療AS最相關(guān)的候選靶點。

圖3 PPI中的核心基因(前20)

2.5靶點功能與通路的富集分析 使用R軟件對80個共同靶點進行富集分析，設(shè)置閾值P<0.05，對P值排序后進行分析并對其結(jié)果進行可視化，由結(jié)果可見白芍-甘草參與的通路主要有IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等，見圖4。其中生物學過程(Biological Process)1820條，分子功能(Molecular Function)119條，細胞組成(Cellular Component)25條。參與生物過程包括脂多糖應答(response to lipopolysaccharide)、對細菌來源的分子反應(response to molecule of bacterial origin)、類固醇代謝過程(steroid metabolic process)、對有毒物質(zhì)的應答(response to toxic substance)、對生物刺激的細胞免疫應答(cellular response to biotic stimulus)等。分子功能中與核受體活性配體激活(nuclear receptor activity ligand-activated)、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity DNA-binding transcription factor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等密切相關(guān)。在細胞組成中細胞膜膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、質(zhì)膜外側(cè)面(external side of plasma membrane)比例最大。見圖5。

圖4 KEGG通路富集分析

圖5 BP、CC、MF分析柱狀圖

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法發(fā)現(xiàn)白芍-甘草治療AS最主要的成分為槲皮素、山柰酚，其中山柰酚為白芍-甘草共同的成分，槲皮素為甘草的主要成分，兩者均為黃酮類化合物。近年來黃酮類化合物被認為是天然藥物中最有效的成分，在體內(nèi)外均有改善炎癥的作用[20]。其中山奈酚通過抑制環(huán)氧合酶(COX)通路的活性來抑制花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，進而減輕炎癥反應，達到較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[21]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)其能顯著降低炎癥生物標志物C反應蛋白(CRP)和炎癥因子IL-6、TNF的表達[22]。槲皮素具有抗炎、抗感染、抗氧化、神經(jīng)保護等藥理活性[23]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過減弱由吲哚美辛誘導的核因子κB(NF-κB)的活化及白細胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生從而抑制胃腸道黏膜黏附分子表達和中性粒細胞浸潤、達到預防或治療非甾體抗炎藥關(guān)于胃腸道的副作用，同時不影響TNF-α介導的前列腺素E2的抑制作用，能在一定程度上增強非甾體抗炎藥物的抗炎活性[24]。

AS導致患者關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變的病理過程可分為炎癥、骨侵蝕、新骨形成三個階段，每個階段的效應通路都可能與TNF有關(guān)，有研究表明TNF對于骨穩(wěn)態(tài)的作用可能與其局部濃度有關(guān)，低濃度下通過上調(diào)Runx2、骨鈣素和堿性磷酸酶水平來增加成骨分化，觸發(fā)骨增殖和新骨形成[25]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法發(fā)現(xiàn)TNF、IL-6和PTGS2為白芍-甘草治療AS最相關(guān)的靶點。早期使用腫瘤壞死因子抑制劑(TNFi)如阿達木單抗(ADA)等，可以減輕患者外周關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學改變、減少AS患者髖關(guān)節(jié)放射學進展[26-27]。IL-6是處于TNF下游的促炎細胞因子，參與著促炎和抗炎通路、代謝控制、骨代謝、神經(jīng)修復和再生過程，在多種惡性腫瘤的調(diào)節(jié)和生長中發(fā)揮重要作用[28-29]。既往研究表明TNF-α、IL-1β和IL-6在AS患者血清中明顯上調(diào)，這些炎癥因子的釋放加速了強直性脊柱炎的發(fā)展[30-31]。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX2)是誘導型酶，由PTGS2基因編碼，是AS炎癥通路啟動的關(guān)鍵酶，主要參與前列腺素和血栓素的生物合成，并將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，通過降低相關(guān)炎癥因子的表達、阻斷前列腺素的產(chǎn)生，可減輕炎癥反應、緩解臨床癥狀[32-33]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，白芍-甘草治療AS可能通過IL-17、TNF、NF-κB、Toll樣受體等信號通路發(fā)揮作用，其中IL-17信號通路被認為參與了AS發(fā)病的炎癥和新骨形成過程[34]。AS的發(fā)病機制涉及單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞等多種免疫細胞[35-36]。其中由T細胞產(chǎn)生的IL-17細胞因子水平在AS患者的關(guān)節(jié)組織中明顯升高，且通過抗IL-17抗體阻斷IL-17A的功能，可阻止SKG(自發(fā)型類風濕關(guān)節(jié)炎)小鼠脊柱中AS樣特征的發(fā)展[37-38]。IL-17可靶向多種細胞，如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，導致炎癥細胞因子如IL-6、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達，從而造成關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[39-40]，這些細胞因子一方面擴大了滑膜的炎癥，另一方面也激發(fā)了骨的過度修復反應，造成了新骨的形成。已有研究證明IL-17可能通過激活巨噬細胞產(chǎn)生的MMPs和成骨細胞呈現(xiàn)的NF-κB配體受體激活劑(RANKL)來影響骨代謝[41]。

綜上所述，白芍-甘草可能通過多成分多靶點多通路抑制新骨形成、降低炎癥反應和炎癥因子等作用，從而延緩病情發(fā)展及改善患者生活質(zhì)量。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法存在一定的局限性，白芍-甘草基于中醫(yī)理論柔肝緩急、以助舒筋，對于其是否具有緩解韌帶骨化方面還需進一步研究證明。通過本文的研究提示：具有柔肝緩急的白芍-甘草的配伍結(jié)構(gòu)，在防治AS患者韌帶骨化方面提供了思路。