夏明升

（安徽省通源環(huán)境節(jié)能股份有限公司，安徽 合肥 230001）

葉綠素是所有光合浮游植物必需的光合色素，通常用作估算生物量的指標(biāo)，也是光合研究的基本參數(shù)。利用有機(jī)溶劑從細(xì)胞中提取葉綠素并采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定是葉綠素定量分析的常用方法。藻類(lèi)細(xì)胞中的大多數(shù)葉綠素分子與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)合，外層有細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及其他結(jié)構(gòu)屏障。如何高效地將葉綠素從細(xì)胞中萃取出來(lái)是準(zhǔn)確測(cè)定藻類(lèi)葉綠素含量的關(guān)鍵。葉綠素的提取方法種類(lèi)繁多，其中最大的區(qū)別是使用的有機(jī)溶劑不同[1]。多數(shù)研究使用丙酮（90%）[2-6]和乙醇（90%）[7-9]，甲醇、二甲亞砜等的應(yīng)用也有少量的研究報(bào)道[10-12]。然而，從不同溶劑提取出的葉綠素產(chǎn)量通常因藻類(lèi)（或植物材料）而異，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)提取不完全的情況。按照公開(kāi)的方法經(jīng)多次提取后，藻顆粒仍然呈深綠色的情況并不少見(jiàn)。

有較多研究對(duì)葉綠素提取方法進(jìn)行了改進(jìn)。研究表明，相比一般有機(jī)溶劑，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）對(duì)葉綠素提取效果更好[13-15]，特別對(duì)一些具有提取抗性的綠藻[14，16]。采用DMF，不必破壞藻細(xì)胞，只需浸泡一會(huì)，即可完成大部分藻類(lèi)的葉綠素提取。然而，當(dāng)我們嘗試從一些綠藻中提取葉綠素時(shí)，參考國(guó)外已發(fā)表的方法[13，17]，在5℃或室溫下，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)浸泡提取，最終藻細(xì)胞團(tuán)仍然呈深綠色，表明針對(duì)具有提取抗性的藻類(lèi)，在常溫條件下采用DMF浸泡提取葉綠素仍然存在一些不足。

升高有機(jī)溶劑的溫度可以提高葉綠素提取效率[18-19]，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10260-1992[8]的葉綠素測(cè)量方法推薦熱乙醇（75℃）浸泡5 min，其他一些報(bào)告也顯示熱丙酮、甲醇和二甲基亞砜（DMSO）比冷溶劑更有效[20-23]。然而，這些公開(kāi)的研究方法似乎對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中的一些頑固的藻類(lèi)來(lái)說(shuō)提取效果不佳。由于較高的溫度可以提高從細(xì)胞中提取的葉綠素含量[24-25]，并且葉綠素可以在低于沸點(diǎn)的溫度下在熱有機(jī)溶劑中穩(wěn)定20 min[18]，沸點(diǎn)高達(dá)153℃的DMF 應(yīng)該是比其他低沸點(diǎn)溶劑更好的選擇。目前還沒(méi)有關(guān)于熱DMF法提取葉綠素的研究報(bào)道。

本研究用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的綠藻蛋白核小球藻（chlorella phyrenoidosa）進(jìn)行熱DMF提取的最佳溫度和浸泡時(shí)間的研究；對(duì)乙醇、丙酮和DMF提取方法進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，改進(jìn)的熱DMF法是一種更有效的葉綠素提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇、丙酮、DMF，分析純；白核小球藻（chlorella phyrenoidosa），采用BG11 培養(yǎng)基，在溫度為28℃、光照強(qiáng)度為3 000 Lx的條件下培養(yǎng)。

UV-2100 紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)，Unico；Centri?fuge 5910 R離心機(jī)，Eppendorf；HWS-28恒溫水浴鍋，上海精密。

1.2 研究方法

1.2.1 葉綠素的提取

藻類(lèi)液體培養(yǎng)物以8 000 g 離心10 min，細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中進(jìn)行葉綠素提取。操作方法和步驟參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10260-1992[8]以及Suzu?ki[20]的報(bào)道。將水浴鍋加熱至預(yù)定溫度后，分別測(cè)試90%丙酮、90%乙醇和純 DMF 對(duì)藻類(lèi)樣品的葉綠素提取效果。熱提取完成后，立即將裝有葉綠素溶液的容器轉(zhuǎn)移到冷水浴中冷卻至室溫。本研究中使用的熱提取方案匯總在表1中。提取完成后，將溶液以10 000 g離心5 min，上清液用于葉綠素定量分析。

1.2.2 測(cè)定與計(jì)算

通過(guò)分光光度計(jì)對(duì)提取物中的葉綠素進(jìn)行定量。以下三個(gè)方程分別用于計(jì)算丙酮、乙醇和DMF 中的葉綠素濃度 Ca，Ce和 Cd（mg·L-1）[8，22，26]。

其中E664，E665和E750為新鮮葉綠素溶液在664 nm，665 nm和750 nm處的吸光度，A664和A665為酸化溶液（在1 min內(nèi)將50 μL 1.0 mol·L-1HCl加入5 mL提取物中）在664 nm，665 nm和750 nm處的吸光度。Va、Ve和Vd分別代表丙酮、乙醇和DMF的提取液體積；Vs是藻液樣品的體積。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

評(píng)估不同提取方法的精度，采用標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（Cv），計(jì)算公式為Cv=（SD/mean）× 100%。

用方差分析（One-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)不同提取方法的葉綠素濃度差異。采用Duncan法對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)比較，差異顯著閾值為p< 0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 熱提取法的最佳溫度

在不同溫度下用DMF 提取的葉綠素濃度如圖1 所示。超過(guò)70℃時(shí)，葉綠素提取率達(dá)到較高水平，90℃時(shí)提取率最高。因此在接下來(lái)的研究中采用90℃進(jìn)行葉綠素的熱DMF提取。

圖1 溫度對(duì)小球藻葉綠素提取的影響Fig.1 Effect of temperature on the chlorophyll extraction from Chlorella

2.2 熱提取法的最佳浸泡時(shí)間

為了找到最佳浸泡時(shí)間，采用熱DMF 法在不同時(shí)間分別測(cè)定了小球藻提取液的葉綠素濃度（圖2）。結(jié)果表明，向樣品中加入熱DMF可迅速溶出葉綠素，經(jīng)過(guò)僅1 min的熱浸泡，DMF便提取出小球藻中的大部分葉綠素，在第5 min 時(shí)，DMF 的葉綠素濃度達(dá)到最高。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素濃度不再升高，結(jié)合小球藻沉淀泛白，表明藻細(xì)胞中的葉綠素已提取完全。

對(duì)葉綠素的有效提取應(yīng)當(dāng)確保葉綠素較少分解，因此我們研究了葉綠素在熱DMF中的穩(wěn)定性。雖然葉綠素在熱DMF 中隨時(shí)間緩慢降解，但在10 min 和20 min內(nèi)降低的百分比分別為1.85%和3.18%（圖3），該結(jié)果表明葉綠素在熱DMF中具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 不同浸泡時(shí)間內(nèi)熱DMF從小球藻中提取的葉綠素濃度Fig.2 The chlorophyll concentration of hot DMF extracted from Chlorella during different soaking time

圖3 葉綠素在90℃DMF中不同保溫時(shí)間內(nèi)的濃度，星號(hào)（＊）表示與對(duì)照（0分鐘）相比有顯著差異（p<0.05）Fig.3 The concentration of chlorophyll in DMF at 90℃for different incubation times.The star mark（＊）means significant difference（p<0.05）compared with the control（0 min）

2.3 不同熱溶劑法的提取效率比較

小球藻是一種難于提取葉綠素的材料，本實(shí)驗(yàn)以小球藻為研究材料，根據(jù)表1的操作步驟，對(duì)熱乙醇、熱丙酮與熱DMF 的葉綠素提取效率進(jìn)行了比較（圖4）。結(jié)果顯示，三種熱溶劑法提取效率存在顯著差異，其中熱DMF（90℃）具有最高的提取效率，熱乙醇法的提取效率次之，熱丙酮法效果最差。采用熱DMF 提取完成后的藻沉淀已泛白，表明葉綠素提取較為徹底；熱乙醇和熱丙酮均無(wú)法從小球藻中完全提取出葉綠素（最終藻沉淀仍呈深綠色）。

圖4 不同熱溶劑法對(duì)小球藻葉綠素提取效率的比較，柱形圖上的不同字母表示差異顯著（p<0.05）Fig.4 Comparison of extraction efficiency of Chlorella chlorophyll by different hot solvent methods.Different letters on the bar chart indicate significant differences（p<0.05）

2.4 不同熱溶劑法的精密度比較

精密度（變異系數(shù)）是評(píng)估實(shí)驗(yàn)方法有效性的重要指標(biāo)。根據(jù)對(duì)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)，本研究計(jì)算了三種熱提取法的標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)（表2），其中熱DMF提取法的數(shù)值最小，表明該法的精密度最好，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。由于DMF 的沸點(diǎn)達(dá)153℃，遠(yuǎn)高于乙醇和丙酮的沸點(diǎn)，因此揮發(fā)性更低，在實(shí)驗(yàn)操作中的溶劑損失更少，誤差更小，這可能是熱DMF法擁有更高精密度的原因。

表2 三種熱溶劑法提取葉綠素的精密度評(píng)價(jià)Tab.2 Evaluation of precision of chlorophyll extraction with different hot solvent methods

3 討論

較高的溫度有利于有機(jī)溶劑提取藻類(lèi)葉綠素，促進(jìn)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞、蛋白質(zhì)的變性，并增加有機(jī)溶劑的滲透性。DMF的沸點(diǎn)高達(dá)153℃，遠(yuǎn)高于丙酮的沸點(diǎn)56.5℃和乙醇的沸點(diǎn)78.3℃，為提取葉綠素提供了更高的溫度范圍。蛋白核小球藻是一種難于提取葉綠素的材料，在本研究中，采用90℃及以上的溫度有利于熱DMF法獲得更好的提取效率。

葉綠素在較高溫度的溶液中不可避免地會(huì)發(fā)生降解[11]。葉綠素在DMF 中具有良好的穩(wěn)定性，在冷DMF中可保存一個(gè)月以上[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在90℃的DMF中，葉綠素濃度在10 min 內(nèi)僅下降了1.85%，損失率很低，基本不影響檢測(cè)結(jié)果。本研究還測(cè)試了在熱DMF中添加MgCO3以防止葉綠素被酸降解，但沒(méi)有觀察到明顯的積極效果（數(shù)據(jù)未列出）。

與傳統(tǒng)方法相比，熱DMF 方法顯示了其優(yōu)越性。首先，傳統(tǒng)方法中的葉綠素提取是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，需要半天甚至過(guò)夜（表3），而熱DMF 只用了不到10 min（包括在冷水中的冷卻時(shí)間）；其次，熱DMF法擁有更高的精密度，檢測(cè)誤差較小；最后，對(duì)于難處理的藻類(lèi)材料，熱DMF法具有更強(qiáng)的葉綠素提取能力。

表3 不同方法提取葉綠素的時(shí)間消耗情況Tab.3 Time consumption for chlorophyll extraction with different methods

綜上所述，改進(jìn)的熱DMF 法是一種高效的藻類(lèi)葉綠素提取方法，特別適合處理具有提取抗性的藻類(lèi)材料。