劉天亮，楊林林，董誠明，高啟國，齊大明，徐曉麗，李江華

基于化學模式識別的不同產(chǎn)地金銀花HPLC指紋圖譜研究

劉天亮1, 2，楊林林1, 2*，董誠明1, 2*，高啟國3，齊大明1, 2，徐曉麗3，李江華3

1. 河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046 2. 河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046 3. 河南太龍藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 450001

建立道地產(chǎn)區(qū)及不同主產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學計量學評價為金銀花質(zhì)評質(zhì)控體系的構(gòu)建及其潛在質(zhì)量標志物的探索提供參考和依據(jù)。采集河南、山東、河北產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品，優(yōu)化提取與檢測方法，建立最佳HPLC指紋圖譜條件。色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件，進樣體積10 μL；檢測波長245 nm；體積流量0.5 mL/min；柱溫38 ℃。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723）對HPLC圖譜數(shù)據(jù)進行共有峰確定、相似度評價。采用SIMCA-P 14.1軟件進行聚類分析（cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。3個產(chǎn)地金銀花HPLC指紋圖譜共匹配45個共有峰成分，標示出16個色譜峰。HCA與PCA結(jié)果可將河南產(chǎn)區(qū)與山東、河北產(chǎn)區(qū)金銀花樣品完全區(qū)分。OPLS-DA分析結(jié)果表明異綠原酸B、香豆酸、莫諾苷、蘆丁、新綠原酸、斷氧化馬錢苷等物質(zhì)含量在河南產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于山東、河北產(chǎn)金銀花；綠原酸、異綠原酸C、木犀草苷在山東產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南、河北產(chǎn)金銀花；忍冬苷在河北產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南、山東產(chǎn)金銀花。所建立的金銀花HPLC指紋圖譜結(jié)合化學計量學的方法，可應(yīng)用于金銀花質(zhì)量標準的研究與開發(fā)及其潛在質(zhì)量標志物和道地因子的探索。

金銀花；指紋圖譜；主成分分析；正交偏最小二乘法判別分析；異綠原酸B；香豆酸；莫諾苷；蘆??；新綠原酸；忍冬苷；斷氧化馬錢苷

金銀花為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，因其臨床療效顯著、使用范圍較廣，素有“植物抗生素”的美譽，具有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值，且收錄于國家衛(wèi)健委發(fā)布的藥食同源目錄。在“保健養(yǎng)生”的消費需求和國家政策的共同推動下，作為特殊農(nóng)業(yè)范疇的中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)，成為了中藥GAP的未來趨勢，加之農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革規(guī)劃，我國政府愈發(fā)重視傳統(tǒng)道地藥材生產(chǎn)技術(shù)及中藥材產(chǎn)地、品質(zhì)、市場等相關(guān)問題[1-3]。

中藥材大多是藥用植物，易受生長環(huán)境、土壤、氣候等資源稟賦的影響。中醫(yī)歷來十分重視道地藥材，對道地藥材的研究不僅推動了中藥鑒定學和生藥學的發(fā)展，更是促進了中藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)價、高產(chǎn)高效的發(fā)展[4-5]。近20年，我國中藥材種植面積穩(wěn)中有升，中藥的質(zhì)量控制和評價也逐漸演變成為制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，“產(chǎn)-學-研”等關(guān)鍵角色的聯(lián)系不夠緊密甚至脫節(jié)，導(dǎo)致市場部分中藥材存在著產(chǎn)量、品質(zhì)、價格等方面良莠不齊的現(xiàn)象，不同程度上影響了中醫(yī)臨床使用的療效。另外，以中藥材為原料的食品、保健品、化妝品消費快速增長，生產(chǎn)安全面臨嚴峻挑戰(zhàn)。

中藥質(zhì)控的現(xiàn)行目標是保證中藥材或制劑的一致性和穩(wěn)定性，而指紋圖譜技術(shù)可分析中藥中有效成分和無效成分的種類和含量分布的信息，符合中醫(yī)中藥整體性和模糊性的特點，是實現(xiàn)鑒別中藥真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式。至今，色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制體系的各個方面物盡其用，包括真實性鑒定（化學指紋圖譜）、有效性評價（譜效學、生物指紋圖譜、代謝指紋圖譜）和安全性評價[6-8]。同時，模式識別技術(shù)是化學計量學的重要組成部分，也是篩選中藥質(zhì)量標志物的重要數(shù)學方法，而指紋圖譜結(jié)合模式識別方法在中藥鑒別、定性表征、質(zhì)量控制、組效關(guān)系等研究中均具有廣泛應(yīng)用[9-10]。

目前，已建立的金銀花色譜指紋圖譜多存在著樣本單一不具有代表性、色譜基線漂移、分離峰數(shù)較少甚至錯誤指認等方面的缺點，樣品提取方法及色譜檢測方法仍有極大的優(yōu)化空間[11-15]。因此，建立一種重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定性可靠、分辨率清晰，同時適用于不同產(chǎn)地金銀花的品質(zhì)評價或不同種屬真?zhèn)舞b別的指紋圖譜分析方法迫在眉睫。

本研究采集了河南、河北、山東3大產(chǎn)區(qū)的65個批次的金銀花樣品，優(yōu)化了提取與檢測方法，建立了基線平穩(wěn)、穩(wěn)定性好、分辨率高的HPLC指紋圖譜，并對金銀花中有機酸類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類等共16種化學成分進行歸屬，結(jié)合化學模式識別技術(shù)，客觀地反映了藥材品質(zhì)的整體性與差異性，為金銀花道地因子的研究、評價體系的構(gòu)建，市場真?zhèn)蔚蔫b別提供了基礎(chǔ)手段，同時對金銀花質(zhì)量標志物的探索提供了新的思路與方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2489型高效液相；Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，美國沃特斯公司；IMS105DU型萬分之一天平，瑞士梅特勒-托利多集團；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW135型粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司等。

1.2 材料

綠原酸（批號PS0131-0025）成都普思生物科技股份有限公司；咖啡酸（批號MUST-16060613）、莫諾苷（批號MUST-15102911），成都曼思特生物科技有限公司；斷馬錢子酸（批號DST190719-136）、忍冬苷（批號DST190708-048）、異槲皮素（批號DST191012-006），成都德思特生物技術(shù)有限公司；斷氧化馬錢苷（批號P27N8L49194）、木犀草苷（批號Y26A9H59973），上海源葉生物科技有限公司；新綠原酸（批號wkq18030107）、異綠原酸A（批號wkq18041207）、異綠原酸B（批號wkq19012301）、異綠原酸C（批號wkq18050905）、阿魏酸（批號wkq18042309）、蘆丁（批號wkq16101104）、當藥苷（批號wkq18042610），四川省維克奇生物科技有限公司。所用對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%；甲醇、乙腈為色譜級，水為超純水，其余均為分析純。

65批金銀花樣品取自于河南、山東、河北各地，詳細信息見表1，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學生藥學科董誠明教授鑒定為忍冬科植物忍冬Thunb.。

表1 金銀花樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件：0～10 min，8%～9% A；10～25 min，9%～11% A；25～35 min，11%～15% A；35～50 min，15%～16% A；50～65 min，16%～20% A；65～75 min，20%～24% A；75～80 min，24%～38% A；進樣體積10 μL；檢測波長245 nm；體積流量0.5 mL/min；柱溫38 ℃。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 提取料液比對結(jié)果的影響 采用50%甲醇為提取液，超聲提取（功率250 W、頻率35 kHz），提取時間30 min，提取料液比分別為1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶200共6份樣品，提取后在245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃色譜條件下測定結(jié)果，考察不同料液比對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳提取料液比為1∶50，結(jié)果見圖1。

a-料液比1∶10 b-料液比1∶25 c-料液比1∶50 d-料液比1∶75 e-料液比1∶100 f-料液比1∶200

2.2.2 提取液甲醇體積分數(shù)對結(jié)果的影響 采用超聲提?。üβ?50 W，頻率35 kHz），提取時間30 min，料液比1∶50，提取液水及甲醇濃度分別為10%、25%、50%、75%、100%共6份樣品，提取后在245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃色譜條件下測定結(jié)果，考察不同甲醇體積分數(shù)對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳提取溶劑為50%甲醇，結(jié)果見圖2。

2.2.3 提取時間對結(jié)果的影響 采用超聲提?。üβ?50 W、頻率35 kHz），料液比1∶50，提取液甲醇體積分數(shù)為50%，提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min共6份樣品，提取后在245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃色譜條件下測定結(jié)果，考察不同提取時間對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳提取時間為30 min，結(jié)果見圖3。

a-水 b-10%甲醇 c-25%甲醇 d-50%甲醇 e-75%甲醇 f-100%甲醇

a-10 min b-20 min c-30 min d-40 min e-50 min f-60 min

綜上，由圖1～3可知，最佳提取工藝為采用50%甲醇為提取液，料液比1∶50，超聲提?。üβ?50 W，頻率35 kHz），提取時間30 min。

2.3 檢測方法優(yōu)化

2.3.1 檢測波長對結(jié)果的影響 采用50%甲醇為提取液，料液比1∶50，超聲提?。üβ?50 W、頻率35 kHz），提取時間30 min，提取后分別在260 nm（a）、255 nm（b）、250 nm（c）、245 nm（d）、240 nm（e）、235 nm（f）、230 nm（g）、225 nm（h）、220 nm（i）、215 nm（j），體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃色譜條件下測定結(jié)果，考察不同檢測波長對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳檢測波長為245 nm，結(jié)果見圖4。

a-260 nm b-255 nm c-250 nm d-245 nm e-240 nm f-235 nm g-230 nm h-225 nm i-220 nm j-215 nm

2.3.2 色譜柱溫對結(jié)果的影響 采用50%甲醇為提取液，料液比1∶50，超聲提取（功率250 W，頻率35 kHz），提取時間30 min，提取后在245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫分別為30 ℃（a）、32 ℃（b）、34 ℃（c）、36 ℃（d）、38 ℃（e）、40 ℃（f）色譜條件下測定結(jié)果，考察不同色譜柱溫對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳檢測柱溫為38 ℃，結(jié)果見圖5。

a-30 ℃ b-32 ℃ c-34 ℃ d-36 ℃ e-38 ℃ f-40 ℃

2.3.3 進樣體積流量對結(jié)果的影響 采用50%甲醇為提取液，料液比1∶50，超聲提取（功率250 W，頻率35 kHz），提取時間30 min，提取后分別在245 nm，柱溫38 ℃，體積流量分別為0.1 mL/min（a）、0.2 mL/min（b）、0.3 mL/min（c）、0.4 mL/min（d）、0.5 mL/min（e）、0.6 mL/min（f）、0.7 mL/min（g）、0.8 mL/min（h）、0.9 mL/min（i）、1.0 mL/min（j）色譜條件下測定結(jié)果，考察不同進樣體積流量對金銀花HPLC指紋圖譜的影響，得最佳體積流量為0.5 mL/min，結(jié)果見圖6。

a-0.1 mL/min b-0.2 mL/min c-0.3 mL/min d-0.4 mL/min e-0.5 mL/min f-0.6 mL/min g-0.7 mL/min h-0.8 mL/min i-0.9 mL/min j-1.0 mL/min

綜上，由圖4～6可知，最佳檢測方法為：檢測波長245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃。

2.4 溶液的制備

2.4.1 對照品溶液 分別精密稱定香豆酸、新綠原酸、莫諾苷、綠原酸、斷馬錢子酸、咖啡酸、當藥苷、斷氧化馬錢苷、阿魏酸、蘆丁、異槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，以50%甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度分別為0.590、0.252、0.966、0.480、0.396、0.420、1.172、0.314、0.352、0.954、0.271、0.373、0.284、0.448、0.430、0.672 mg/mL的儲備液，另分別取各儲備液適量，以50%甲醇定容至5 mL作為混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液 根據(jù)“2.2提取工藝優(yōu)化”項下結(jié)果，精密稱取金銀花粉末1 g置錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，稱定并記錄重量，超聲提取30 min（功率250 W，頻率35 kHz），冷卻后以50%甲醇補足失重，搖勻過濾，即得。

2.5 樣品測定

根據(jù)“2.3”項下結(jié)果，取65批金銀花，按“2.4.2”項制備供試品溶液，在檢測波長245 nm，體積流量0.5 mL/min，柱溫38 ℃色譜條件下，進樣10 μL進行測定，得金銀花混合對照品圖譜及樣品指紋圖譜見圖7。

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度試驗 取金銀花供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進樣6次，以8號峰斷氧化馬錢苷為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積RSD值，結(jié)果表明16個共有峰的相對保留時間RSD為0.06%～0.25%，相對峰面積RSD為0.16%～1.93%。

1-香豆酸 2-新綠原酸 3-莫諾苷 4-綠原酸 5-斷馬錢子酸 6-咖啡酸 7-當藥苷 8-斷氧化馬錢苷 9-阿魏酸 10-蘆丁 11-異槲皮素 12-木犀草苷 13-忍冬苷 14-異綠原酸B 15-異綠原酸A 16-異綠原酸C

1-cumalic acid 2-neochlorogenic acid 3-morroniside 4-chlorogenic acid 5-secologaninsaeure 6-caffeic acid 7-sweroside 8-secoxyloganin 9-ferulic acid 10-troxerutin 11-isoquercetin 12-cynaroside 13-xylostein 14-isochlorogenic acid B 15-isochlorogenic acid A 16-isochlorogenic acid C

圖7 金銀花樣品(a)及混合對照品(b) HPLC圖譜

Fig. 7 HPLC profile ofsample (a) and mixed reference substance (b)

2.6.2 重復(fù)性試驗 按“2.4.2”項下平行稱取6份金銀花樣品，分別制備成供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。以8號峰斷氧化馬錢苷為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積RSD值，結(jié)果表明16個共有峰的相對保留時間RSD為0.17%～0.58%，相對峰面積RSD為1.52%～4.02%。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取金銀花供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別在0、4、8、16、20、24、48 h進樣，以斷氧化馬錢苷為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積RSD值，結(jié)果表明16個共有峰的相對保留時間RSD為0.13%～0.82%，相對峰面積RSD為0.75%～4.62%。

2.7 數(shù)據(jù)處理

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723）對HPLC圖譜數(shù)據(jù)進行共有峰確定、相似度評價；用SIMCA-P 14.1軟件進行聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，）。

2.8 化學計量學分析

2.8.1 不同產(chǎn)地金銀花HPLC指紋圖譜的建立采用ChemPattern_v1.0繪制各產(chǎn)地金銀花樣品疊加圖譜，見圖8～10；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723）分別對各產(chǎn)地金銀花HPLC指紋圖譜進行共有峰確定及相似度評價，以平均數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度0.5。經(jīng)全譜峰匹配后生成對照圖譜，見圖11，各產(chǎn)地不同批次金銀花樣品HPLC圖譜與對照圖譜相似度結(jié)果見表2。

圖8 31批河南產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜

圖9 19批山東產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜

圖10 15批河北產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜

由結(jié)果可知，31批河南產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜匹配共有峰67個，其中第11、13、16、19、21、22、29、37、40、44、47、48、51、55、56、65號峰分別對應(yīng)為香豆酸、新綠原酸、莫諾苷、綠原酸、斷馬錢子酸、咖啡酸、當藥苷、斷氧化馬錢苷、阿魏酸、蘆丁、異槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，與對照圖譜相似度范圍在0.883～0.995，除HN9、HN7之外相似度范圍在0.963～0.995；19批山東產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜匹配共有峰52個，其中第8、9、14、17、20、21、25、29、32、35、38、39、40、43、44、48號峰分別對應(yīng)為香豆酸、新綠原酸、莫諾苷、綠原酸、斷馬錢子酸、咖啡酸、當藥苷、斷氧化馬錢苷、阿魏酸、蘆丁、異槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，與對照圖譜相似度范圍在0.905～0.997；15批河北產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜匹配共有峰61個，其中第12、15、18、20、24、25、33、38、41、44、45、47、49、55、56、60號峰分別對應(yīng)為香豆酸、新綠原酸、莫諾苷、綠原酸、斷馬錢子酸、咖啡酸、當藥苷、斷氧化馬錢苷、阿魏酸、蘆丁、異槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，與對照圖譜相似度范圍在0.993～0.995。

圖11 河南(a)、山東(b)、河北(c) 產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC對照指紋圖譜

表2 金銀花HPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

2.8.2 HCA及PCA 采用SIMCA-P 14.1軟件對河南、山東、河北3個產(chǎn)地的金銀花樣品HPLC圖譜結(jié)果進行HCA、PCA，為了使結(jié)果能夠最大程度地反映樣本信息，數(shù)據(jù)分析時，選用各產(chǎn)地間所匹配的全部共有峰進行計算，包括16個已標示出的共有峰，各產(chǎn)地金銀花樣本聚類分析結(jié)果見圖12，主成分分析得分圖見圖13，各產(chǎn)地金銀花樣本主成分分析特征值及方差貢獻率見表3～5。

圖12 河南(a)、山東(b)、河北(c)各產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜HCA結(jié)果

圖13 河南(a)、山東(b)、河北(c) 各產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜PCA結(jié)果

表3 河南產(chǎn)區(qū)金銀花樣品主成分分析特征值及方差貢獻率

表4 山東產(chǎn)區(qū)金銀花樣品主成分分析特征值及方差貢獻率

表5 河北產(chǎn)區(qū)金銀花樣品主成分分析特征值及方差貢獻率

由結(jié)果可知，31批河南產(chǎn)金銀花樣本聚類結(jié)果分為2類，且2類樣本整體分布集中，主成分分析自動擬合5個主成分，特征值均大于1，累積方差貢獻率74.5%；19批山東產(chǎn)金銀花聚類結(jié)果整體分為3類，其中1類分布較為集中，其余2類較為離散，主成分分析自動擬合4個主成分，特征值均大于1，累積方差貢獻率72.6%；15批河北產(chǎn)金銀花聚類結(jié)果整體分為2類，但2類樣本均分布較為離散，主成分分析自動擬合5個主成分，其中前4個主成分特征值大于1，累積方差貢獻率86.3%。

為更好地區(qū)分不同產(chǎn)地金銀花樣品之間的差異，根據(jù)HCA及PCA結(jié)果，在各產(chǎn)地不同批次樣本中分別篩選出10批相似度接近，綜合得分分布集中的樣品，使其更能代表其產(chǎn)地信息，進行更為細致深入的分析，以3個產(chǎn)地共有峰交集數(shù)據(jù)（共計匹配45個共有峰，包括16個已標示的共有峰），導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行聚類分析，聚類方法采用組間連接法，聚類距離為歐氏平方距離，結(jié)果見圖14，繪制3個產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜PCA得分圖，見圖15。

由圖14可知，當聚類距離等于20時，3個產(chǎn)地30批次樣品整體分為2類，其中河南產(chǎn)地10批樣品聚為1類，山東產(chǎn)地與河北產(chǎn)地20批樣品聚為1類；當聚類距離等于10時，山東與河北產(chǎn)地金銀花樣品分為2類，其中SD7與河北10批樣品聚為1類，剩余山東9個批次樣品聚為1類；主成分分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致，可以看出河南產(chǎn)金銀花樣品綜合得分整體分布集中，且可與山東、河北金銀花樣品完全區(qū)分，山東產(chǎn)金銀花樣品綜合得分分布相對離散，河北產(chǎn)金銀花樣品綜合得分分布較為集中但與山東產(chǎn)金銀花有部分重疊，無法完全區(qū)分。

圖14 3個產(chǎn)區(qū)金銀花HCA結(jié)果

圖15 3個產(chǎn)區(qū)金銀花PCA結(jié)果

2.8.3 OPLS-DA 不同于PCA，OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，該方法基于OPLS，使分類信息主要集中在主成分上，建立樣品類別之間的關(guān)系模型，并且使模型易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。近年來，這種方法在理論和應(yīng)用方面得到了迅速地發(fā)展，并在計量化學中有大量的應(yīng)用，而在其相關(guān)的中藥領(lǐng)域應(yīng)用更加廣泛，常作為生藥質(zhì)量評價、中藥炮制前后成分差異研究、中藥藥理代謝組學及中藥潛在質(zhì)量標志物探索的基礎(chǔ)方法之一[16-18]。

斷氧化馬錢苷為金銀花中環(huán)烯醚萜苷類成分之一，現(xiàn)代藥理學研究表明其作用較綠原酸及木犀草苷而言，更貼合金銀花傳統(tǒng)臨床應(yīng)用功效，且具有保肝利膽等作用[19]，因其色譜峰位置居中，在各批次樣品中的穩(wěn)定性最好且具有良好的分離度，故選取其為參照峰。以河南產(chǎn)金銀花樣品為對照組，將30批樣品16個共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件分別建立兩兩分組比較的OPLS-DA模型。模型參數(shù)和分別表示所建模型對和矩陣的解釋率，2表示模型的預(yù)測能力，變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）表示差異成分對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力（通常以VIP值＞1作為篩選標準），OPLS-DA得分圖的橫坐標表示組間的差異，縱坐標表示組內(nèi)的差異。河南-山東產(chǎn)金銀花判別模型（M1）與河南-河北產(chǎn)金銀花判別模型（M2）見圖16、17，VIP值見圖18、19。

由結(jié)果可知，河南-山東產(chǎn)金銀花判別模型（M1），2＝0.813，RY＝0.984，Q2＝0.975，表明所建立的模型解釋率和預(yù)測力良好、可靠，結(jié)合VIP值可知，VIP大于1的成分有異綠原酸A、異綠原酸B和綠原酸；河南-河北產(chǎn)金銀花判別模型（M2），RX＝0.855，RY＝0.990，2＝0.980，表明所建立的模型解釋率良好，預(yù)測力可靠，結(jié)合可知，異綠原酸B＞異綠原酸A＞綠原酸＞1。

圖16 河南-山東金銀花OPLS-DA分析得分圖

圖17 河南-河北金銀花OPLS-DA分析得分圖

圖18 河南-山東金銀花變量VIP

圖19 河南與河北金銀花變量VIP

另外，研究或比較2個OPLS模型之間所共同的或獨特的差異化合物，可以通過共享與特有化合物結(jié)構(gòu)分析圖（Shared and unique structure-plot, SUS-plot）來實現(xiàn)，將2個OPLS模型進行對比分析，研究其中化合物在2個模型中的變化趨勢的異同性[20]。在2個模型中變化趨勢一致或者相反的化合物，2個模型所特有的化合物分別出現(xiàn)在平面坐標軸不同象限的特定區(qū)域，便于發(fā)現(xiàn)、歸類和分析。以河南-山東產(chǎn)金銀花判別模型（M1）為縱坐標（），以河南-河北產(chǎn)金銀花判別模型（M2）為橫坐標（），繪制3個產(chǎn)區(qū)金銀花樣品共享與特有化合物結(jié)構(gòu)分析圖（SUS-plot），見圖20。

由圖20可知，其第1、2象限對應(yīng)河南-山東產(chǎn)金銀花判別模型（M1）正方向，結(jié)合圖16“河南與山東金銀花判別OPLS-DA分析得分圖”可知山東產(chǎn)金銀花樣品分布于模型（M1）的正方向，因此圖20中第1、2象限中所示化合物成分在山東產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南產(chǎn)金銀花樣品，第3、4象限所標示化合物成分普遍低于河南產(chǎn)金銀花樣品；同理可得，結(jié)合圖17“河南-河北金銀花判別OPLS-DA分析得分圖”可知河北產(chǎn)金銀花樣品分布于模型（M2）的正方向，其第1、4象限對應(yīng)河南-河北產(chǎn)金銀花判別模型（M2）正方向，因此圖20中第1、4象限中所示化合物成分在河北產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南產(chǎn)金銀花樣品，第2、3象限所標示化合物成分普遍低于河南產(chǎn)金銀花樣品。綜上所述，即在圖20中第1象限所示成分（異綠原酸A、當藥苷、咖啡酸、阿魏酸）在河南產(chǎn)金銀花樣品中普遍低于山東、河北產(chǎn)金銀花；第2象限所示成分（綠原酸、異綠原酸C、木犀草苷）在山東產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南產(chǎn)金銀花，河南產(chǎn)金銀花普遍高于河北產(chǎn)金銀花；第3象限所示成分（異綠原酸B、香豆酸、莫諾苷、蘆丁、新綠原酸、斷氧化馬錢苷）在河南產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于山東、河北產(chǎn)金銀花；第4象限所示成分（忍冬苷）在河北產(chǎn)金銀花樣品中普遍高于河南產(chǎn)金銀花，河南產(chǎn)金銀花普遍高于山東產(chǎn)金銀花。

圖20 3個產(chǎn)區(qū)金銀花樣品共享與特有化合物結(jié)構(gòu)分析圖（SUS-plot）

3 討論

本研究根據(jù)市場調(diào)研，依據(jù)產(chǎn)地種植面積、種植密度，采集了河南、山東、河北3個主產(chǎn)區(qū)的65批金銀花樣品，使取樣具有真實性、代表性；系統(tǒng)考察了提取溶液甲醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、檢測波長、體積流量、柱溫等條件，建立了重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定性可靠、分辨率清晰的適用于不同產(chǎn)地金銀花品質(zhì)評價的HPLC指紋圖譜條件，并結(jié)合化學識別模式建立了擬合信息豐富、預(yù)測能力優(yōu)良、判別能力精準的不同產(chǎn)地的數(shù)學模型。

在對不同產(chǎn)地批次的金銀花HPLC指紋圖譜結(jié)果進行分析的過程中，根據(jù)研究目的采取了逐步分析的方法，首先建立起不同產(chǎn)地HPLC指紋圖譜，對產(chǎn)地內(nèi)不同批次的樣品，以匹配到的全部共有峰作為數(shù)據(jù)源進行聚類分析及主成分分析，使其分析結(jié)果在極大程度上反映了樣本的真實信息及產(chǎn)地內(nèi)金銀花商品品質(zhì)的穩(wěn)定性，可以看出河南產(chǎn)金銀花品質(zhì)相對來說更加穩(wěn)定集中，而山東和河北產(chǎn)金銀花品質(zhì)相對分布離散。然后，根據(jù)產(chǎn)地內(nèi)初步的分析結(jié)果，進行了樣本的篩選，每個產(chǎn)地之中選出10個分布最為集中的批次，目的是在保證數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義及樣本代表性的前提下，使所篩選出的金銀花樣品最能代表產(chǎn)地特征，再進行產(chǎn)地間的判別分析，在對產(chǎn)地間金銀花HPLC指紋圖譜進行分析時，通過共享與特有化合物結(jié)構(gòu)分析，數(shù)據(jù)選用已標示的16個共有峰成分，使結(jié)果具有可行性及可驗證性。

HPLC指紋圖譜技術(shù)與化學模式識別技術(shù)結(jié)合起來能體現(xiàn)出更多的樣本信息，并且在評價藥材質(zhì)量和質(zhì)量控制上顯示了此法的適用性。通過對指紋圖譜進行化學計量學分析，可以客觀地反映了藥材品質(zhì)的整體性與差異性，且本研究所建立的方法與模型，同樣可以應(yīng)用于金銀花不同品種、不同部位、不同采收時期及不同加工方式的品質(zhì)研究，為其種質(zhì)種源評價、綜合開發(fā)利用、原料藥穩(wěn)定性及加工方式優(yōu)化提供研究基礎(chǔ)和方法，為優(yōu)質(zhì)金銀花規(guī)范化生產(chǎn)基地建設(shè)及其潛在中藥質(zhì)量標志物的探索提供參考和依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on HPLC fingerprint offrom different areas based on chemical pattern recognition

LIU Tian-liang1, 2, YANG Lin-lin1, 2, DONG Cheng-ming1, 2, GAO Qi-guo3, QI Da-ming1, 2, XU Xiao-li3, LI Jiang-hua3

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Provincial Ecological Planting Engineering Technology Research Center of Authentic Medicinal Materials, Zhengzhou 450046, China 3. Taloph Pharmaceutical Co., Ltd, Zhengzhou 450001, China

To establish HPLC fingerprints offrom different producing areas, in order to provide reference and basis for the construction of quality evaluation system and the exploration of potential quality markers ofcombined with chemometrics.The extraction and detection methods offrom Henan, Shandong and Hebei were optimized, and the optimal HPLC fingerprint conditions were established. Chromatographic column: symmetry C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase: acetonitrile (a)-0.2% formic acid aqueous solution (b); gradient elution conditions; injection volume: 10 μL; detection wavelength: 245 nm; flow rate: 0.5%. The column temperature was 38oC . HPLC fingerprint similarity evaluation system (2012.130723) was used to determine common peaks and evaluate similarity. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were performed by SIMCA-P 14.1 software.The HPLC fingerprints offrom three regions matched 45 common peaks and 16 peaks were identified. The results of HCA and PCA can completely distinguish the samples from Shandong and Hebei provinces. The results of OPLS-DA showed that the samples from Henan Province contained the most isochlorogenic acid B, cumalic acid, morroniside; troxerutin, neochlorogenic acid and secoxyloganin; The samples from Shandong Province contained the most chlorogenic acid, isochlorogenic acid C and cynaroside; the samples from Hebei Province contained the most xylostein.The HPLC fingerprint ofcombined with chemometrics can be applied to the research and development of the quality standard ofand the exploration of its potential Q-Markers and daodi factors .

; fingerprint; PCA; OPLS-DA; isochlorogenic acid B; cumalic acid; morroniside; troxerutin; neochlorogenic acid; secoxyloganin; cynaroside

R286.2

A

0253 - 2670(2022)15 - 4833 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.027

2021-12-03

國家自然科學基金資助項目（81603232）；河南中醫(yī)藥大學博士科研基金資助項目（BSJJ2015-13）

劉天亮，在讀碩士，專業(yè)方向為中藥材規(guī)范化種植、中藥資源與質(zhì)量評價。E-mail: 974809832@qq.com

通信作者：楊林林，講師，從事于主要從事藥用植物栽培生理與生態(tài)學研究。Tel: 13180883352 E-mail: yangll-hatcm@hactcm.edu.cn

董誠明，教授，主要從事藥用植物學、中藥資源學研究。Tel/Fax: (0371)86535313 E-mail: dcm663@sina.com

[責任編輯 時圣明]