李東紅，徐翠珊，韓德恩，王孟琰，張運(yùn)克，賈永艷, 3*

復(fù)方麝香黃芪滴丸中7個(gè)活性成分在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

李東紅1，徐翠珊1，韓德恩1，王孟琰1，張運(yùn)克2*，賈永艷1, 3*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046 3. 河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046

研究復(fù)方麝香黃芪滴丸中7個(gè)活性成分（-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷、芍藥苷）在正常大鼠與腦缺血再灌注損傷模型大鼠的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，探討其藥動(dòng)學(xué)規(guī)律差異。SD大鼠ig復(fù)方麝香黃芪滴丸后采集不同時(shí)間點(diǎn)血漿，應(yīng)用超高效液相色譜?四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）測(cè)定血藥濃度，采用Kinetica 5.1藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算各給藥組中7個(gè)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并使用SPSS單因素方差分析藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在ig低、中、高劑量復(fù)方麝香黃芪滴丸的正常大鼠和腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)是否存在顯著性差異。7個(gè)生物活性成分的某些藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)有顯著性差異。各劑量下的-藁本內(nèi)酯的達(dá)峰濃度（max）均較正常組明顯升高，藥時(shí)曲線下面積（AUC）在低劑量時(shí)明顯增加；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷AUC有所降低；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的半衰期有所增加。為進(jìn)一步探討復(fù)方麝香黃芪滴丸治療腦缺血疾病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為臨床制定科學(xué)合理的用藥策略提供參考。

復(fù)方麝香黃芪滴丸；腦缺血再灌注損傷；藥動(dòng)學(xué)；-藁本內(nèi)酯；芒柄花素；毛蕊異黃酮；刺芒柄花苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；苦杏仁苷；芍藥苷

復(fù)方麝香黃芪滴丸是在經(jīng)典名方補(bǔ)陽(yáng)還五湯[1]的基礎(chǔ)上加麝香、冰片經(jīng)提取加工而成的復(fù)方制劑，用于缺血性腦卒中的治療。其有效成分主要為黃芪的黃酮類(lèi)組分、當(dāng)歸和川芎的內(nèi)酯組分、桃仁的苷類(lèi)組分和白芍的萜類(lèi)組分等，這些成分具有抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、預(yù)防并治療多種心血管并發(fā)癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)等作用[2-8]，是該制劑的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥藥動(dòng)學(xué)研究在促進(jìn)中藥現(xiàn)代化中發(fā)揮著重要作用，生理及病理的差異會(huì)影響機(jī)體的內(nèi)部環(huán)境，從而改變中藥在機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程，導(dǎo)致藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化[9]。因此對(duì)于創(chuàng)新中藥來(lái)說(shuō)，生理和病理狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)研究都是不可或缺的部分。復(fù)方麝香黃芪滴丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)多樣，藥理藥效顯著，但其在體內(nèi)的吸收利用過(guò)程尚無(wú)研究支持。根據(jù)本課題組的前期研究，-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷同時(shí)存在于滴丸的體外制劑和體內(nèi)血清中[10]，是復(fù)方麝香黃芪滴丸治療缺血性腦卒中的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究擬選取復(fù)方麝香黃芪滴丸中-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷共7個(gè)代表性藥效物質(zhì)，借助超高效液相色譜?四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)，研究復(fù)方麝香黃芪滴丸在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，對(duì)比分析復(fù)方麝香黃芪滴丸在正常和疾病狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律差異，以期為該制劑治療腦缺血疾病的作用機(jī)制和制定科學(xué)合理的臨床用藥策略提供參考意義。

1 材料

1.1 藥品與試劑

對(duì)照品芒柄花素（批號(hào)wkq19013002）、毛蕊異黃酮（批號(hào)wkq19011810）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)wkq19011506）、苦杏仁苷（批號(hào)wkq19012401）、芍藥苷（批號(hào)wkq20041008）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；對(duì)照品-藁本內(nèi)酯（批號(hào)MUST-20041005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、刺芒柄花苷（批號(hào)MUST-20041101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.54%）均購(gòu)自成都曼斯特有限公司；卡馬西平對(duì)照品（批號(hào)H07J9L63102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；注射用青霉素鈉（批號(hào)F9058606）購(gòu)自華北制藥股份有限公司；復(fù)方麝香黃芪滴丸（批號(hào)20210101）為本實(shí)驗(yàn)室自制，-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.18、0.02、0.08、0.18、0.24、0.21、0.14 mg/g；質(zhì)譜級(jí)甲醇購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；水為自制超純水。

1.2 儀器

Vanquish-Orbitrap Fusion高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)、Xcalibur工作站、Heraeus Multifuge X1R型冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；AE240型十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)梅特勒公司）；BSA224S-CW型萬(wàn)分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-QPOD型超純水制備器（美國(guó)Millipore公司）；ANPEL DC-24型氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；勻漿器（上?？普苌萍加邢薰荆籗HA-C型水浴振蕩器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，8周齡，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)1周以適應(yīng)新環(huán)境，晝夜各半循環(huán)照明，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核（編號(hào)DWLL202103143），實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥與樣品采集

2.1.1 正常大鼠給藥及樣品采集 雄性SD大鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為空白組及復(fù)方麝香黃芪滴丸低、中、高劑量（7.8、15.6、31.2 g/kg，分別相當(dāng)于1、2、4倍臨床劑量）組，各劑量相當(dāng)于單體給藥量見(jiàn)表1。復(fù)方麝香黃芪滴丸加水，50～60 ℃水浴加熱使溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的溶液。各給藥組ig相應(yīng)藥物，空白組ig水；在給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24 h時(shí)間點(diǎn)通過(guò)眼眶靜脈取血，每次采血量0.5 mL，收集在含肝素的1.5 mL離心管中。全血靜置30 min后，4 ℃、4000 r/min離心10 min，分取上層血漿，即得血漿樣品，于?80 ℃冰箱中保存。

表1 各成分的給藥劑量

2.1.2 腦缺血再灌注損傷模型的建立、給藥及樣品采集 取27只雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。造模前所有大鼠禁食12 h，自由飲水。參照Z(yǔ)ea-Longa改良線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型[11-12]。造模24 h后，采用Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，評(píng)分為2.4±0.5，表明造模成功。制備正常大鼠和模型大鼠大腦的冠狀切片，使用2% TTC染色，多聚甲醛固定，腦梗死區(qū)域呈白色，正常區(qū)域呈紅色，進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，見(jiàn)圖1。造模成功大鼠共23只，隨機(jī)分為空白組（5只）及復(fù)方麝香黃芪滴丸低、中、高劑量（7.8、15.6、31.2 g/kg，分別相當(dāng)于1、2、4倍臨床劑量，每組6只）組，各給藥組ig相應(yīng)藥物，空白組ig水。血漿樣品采集按“2.1.1”項(xiàng)下方法處理。

圖1 正常大鼠和模型大鼠腦切片染色結(jié)果

2.2 血漿樣品處理

分別精密吸取血漿樣品200 μL于2 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液（14.12 ng/mL）50 μL和甲醇800 μL，渦旋1 min，置于振蕩器上振蕩15 min，再以12 000 r/min離心10 min，取上清液，氮吹儀吹干，殘?jiān)尤氤跏剂鲃?dòng)相100 μL，渦旋使溶解，12 000 r/min離心10 min，取上層溶液，作為供試品溶液，取5 μL進(jìn)樣分析。

2.3 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷、芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇分別配制得到含-藁本內(nèi)酯0.500 mg/mL、芒柄花素0.594 mg/mL、毛蕊異黃酮0.514 mg/mL、刺芒柄花苷0.440 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.212 mg/mL、苦杏仁苷0.588 mg/mL、芍藥苷0.240 mg/mL的對(duì)照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)取卡馬西平對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成0.706 mg/mL卡馬西平內(nèi)標(biāo)對(duì)照品貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 測(cè)定條件

2.4.1 色譜條件 Accucore TM C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～2 min，20%～42% B；2～5 min，42%～45% B；5～7 min，45%～62% B；7～9 min，62%～72% B；9～11 min，72%～85% B；11～14 min，85%～100% B；體積流量為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI）；載氣為氮?dú)?；鞘氣體積流量4.09 L/min；輔助氣體積流量6.4 L/min；掃氣體積流量0 L/min；噴霧電壓＋3.50 kV、?2.50 kV；離子傳輸管300 ℃；氣化溫度275 ℃；掃描方式采用正負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式，其中一級(jí)全掃描（分辨率為120 000），二級(jí)掃描（分辨率為15 000），碰撞能量35%，正、負(fù)離子掃描范圍均為/100～1000。除正、負(fù)離子掃描方式外采用選擇離子掃描模式（分辨率為60 000），待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)化合物的離子基本信息見(jiàn)表2。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專(zhuān)屬性考察 取加入混合對(duì)照品溶液的空白血漿樣品、大鼠ig復(fù)方麝香黃芪滴丸后的含藥血漿樣品和空白血漿樣品，按照“2.2”項(xiàng)下的生物樣品處理方法處理后，按“2.4”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷、芍藥苷的保留時(shí)間分別為10.44、7.30、9.24、5.68、3.81、2.69、3.50 min，分離度良好且儀器響應(yīng)度高。血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他物質(zhì)均不干擾大鼠體內(nèi)各待測(cè)成分的含量測(cè)定。

表2 待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)化合物離子基本信息

A-質(zhì)控樣品 B-含藥血漿 C-空白血漿

2.5.2 線性范圍與定量限考察 精密吸取各對(duì)照品溶液適量，混合均勻，采用甲醇梯度稀釋的方法分別稀釋成一定質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，取空白血漿200 μL，加入各質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液和卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液各50 μL，制得一系列不同質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，應(yīng)用Xcalibur軟件以內(nèi)標(biāo)法對(duì)各成分進(jìn)行分析。以血漿中實(shí)際被測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以血漿中被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸計(jì)算，求得回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，血漿樣品中各成分線性內(nèi)的最低質(zhì)量濃度的信噪比均大于10，將其最低質(zhì)量濃度作為定量下限。對(duì)照品質(zhì)量濃度梯度、回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照品質(zhì)量濃度梯度、回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 精密取大鼠空白血漿，分別加入高、中、低3個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下生物樣品處理方法，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備6份，制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度日內(nèi)平行測(cè)定3次及連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算質(zhì)控樣品的質(zhì)量濃度，計(jì)算高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。結(jié)果表明精密度不超過(guò)10%，準(zhǔn)確度在±10%以內(nèi)，說(shuō)明該測(cè)定方法準(zhǔn)確，可用于大鼠血漿化合物測(cè)定。

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 共配制3組樣品，每組樣品高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6個(gè)樣本（來(lái)自不同供體）。3組樣品分別為對(duì)照品溶液（A）；空白基質(zhì)加對(duì)照品溶液制備質(zhì)控樣品，再按“2.2”項(xiàng)下處理樣品（B）；空白基質(zhì)經(jīng)“2.2”項(xiàng)下樣品前處理后再加入對(duì)照品溶液（C）。將3組樣品進(jìn)樣分析，通過(guò)每組樣品的峰面積計(jì)算提取回收率（B/C）和基質(zhì)效應(yīng)（C/A）。待測(cè)成分的平均基質(zhì)效應(yīng)為83.87%～105.93%，表明該方法對(duì)大鼠血漿中待測(cè)成分的測(cè)定沒(méi)有明顯干擾；待測(cè)成分的平均提取回收率為83.79%～102.22%，表明樣品在制備過(guò)程中待測(cè)成分沒(méi)有顯著損耗，基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的RSD均在10%以內(nèi)，符合生物樣本分析的規(guī)定。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別制備高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定9份，分別考察以下3種情況的穩(wěn)定性：①短期穩(wěn)定性：將處理好待分析的樣品在4 ℃樣品盤(pán)放置12 h；②凍融穩(wěn)定性：將處理后的樣品在?20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次；③長(zhǎng)期穩(wěn)定性：將待分析的樣品在?80 ℃凍存15 d。待測(cè)成分的短期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好，各成分高、中、低質(zhì)量濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差絕對(duì)值均≤6.73%，符合生物樣本分析的規(guī)定。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

大鼠ig復(fù)方麝香黃芪滴丸后，按照上述所建立的方法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)（），血藥質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（）繪制平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖3。采用Kinetica 5.1藥動(dòng)學(xué)軟件以非房室模型分析法計(jì)算各給藥組各個(gè)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括藥時(shí)曲線下面積（AUC）、平均滯留時(shí)間（MRT）、達(dá)峰濃度（max）、達(dá)峰時(shí)間（max）、半衰期（1/2）等，所有參數(shù)以表示，并用SPSS單因素方差分析各個(gè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在ig低、中、高劑量復(fù)方麝香黃芪滴丸的正常大鼠和模型大鼠體內(nèi)是否存在顯著性差異。如表4所示，與正常大鼠相比，在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)，-藁本內(nèi)酯的C在各劑量組中均明顯升高（＜0.01），T無(wú)明顯改變，而AUC在低劑量組中明顯增加（＜0.01）；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷的AUC有所降低（＜0.05、0.01）；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的半衰期有所增加。

圖3 7種活性成分正常大鼠(A) 及模型大鼠(B) 體內(nèi)的藥時(shí)曲線

表4 7種活性成分在正常大鼠和模型大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 6)

Table 4 Pharmacokinetic parameters of seven active ingredients in plasma of normal rats and model rats (, n = 6)

表4 7種活性成分在正常大鼠和模型大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 6)

化合物參數(shù)正常大鼠模型大鼠 復(fù)方麝香黃芪滴丸7.8 g·kg?1復(fù)方麝香黃芪滴丸15.6 g·kg?1復(fù)方麝香黃芪滴丸31.2 g·kg?1復(fù)方麝香黃芪滴丸7.8 g·kg?1復(fù)方麝香黃芪滴丸15.6 g·kg?1復(fù)方麝香黃芪滴丸31.2 g·kg?1 Z-藁本內(nèi)酯Cmax/(ng·mL?1)34.13±1.1957.67±1.79113.93±9.2865.01±4.13**89.06±2.21**162.83±19.05** Tmax/h0.75±0.000.75±0.000.71±0.100.71±0.100.75±0.000.75±0.00 AUC0～t/(ng·h·mL?1)177.16±7.78372.79±15.23691.45±14.18312.16±29.69**341.02±18.29687.47±17.42 AUC0～∞/(ng·h·mL?1)188.92±10.24403.33±13.20738.21±15.83322.08±27.95**358.39±16.80741.15±29.03 t1/2/h6.07±0.616.41±0.516.06±0.304.16±0.46**5.02±0.60**6.89±1.06* MRT0～t/h6.19±0.277.00±0.146.83±0.265.27±0.30**5.24±0.20**6.20±0.47** MRT0～∞/h7.83±0.629.00±0.418.48±0.476.05±0.62**6.51±0.45**8.21±1.18 CL/(L·h?1)1.91±0.101.79±0.061.96±0.041.04±0.10**1.86±0.091.80±0.07 Vss/L14.96±0.8816.13±1.0416.57±0.876.33±1.14**12.14±1.28**14.73±1.69* 芒柄花素Cmax/(ng·mL?1)17.87±1.9037.66±5.0393.36±6.4933.08±1.46**34.76±4.3479.75±11.33** Tmax/h0.50±0.000.29±0.100.33±0.130.25±0.00**0.42±0.200.42±0.13 AUC0～t/(ng·h·mL?1)69.99±3.26144.39±20.86369.04±21.90102.97±5.00140.67±18.25357.38±54.76 AUC0～∞/(ng·h·mL?1)76.09±3.01160.87±25.39415.10±30.52107.41±5.72155.10±18.40402.49±62.33 t1/2/h5.93±0.687.77±1.368.95±0.954.83±1.237.64±1.588.35±1.26 MRT0～t/h5.87±0.176.69±0.546.08±0.314.68±0.31**6.06±0.62*6.59±0.46 MRT0～∞/h8.02±0.499.59±1.369.49±1.015.77±0.56**8.82±1.849.90±0.45 CL/(L·h?1)0.48±0.020.46±0.070.35±0.030.31±0.02**0.44±0.05**0.34±0.05** Vss/L3.86±0.334.39±0.503.34±0.231.81±0.17**3.88±1.003.37±0.49

續(xù)表4

與同等劑量正常組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01normal group at the same dose

3 討論

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)7個(gè)成分進(jìn)行正、負(fù)離子掃描模式測(cè)定進(jìn)行比較分析，各個(gè)成分在正離子模式下響應(yīng)更好，確定均在正離子模式下檢測(cè)，芍藥苷[M＋Na]+比[M＋H]+響應(yīng)好，故芍藥苷采用[M＋Na]+離子峰進(jìn)行檢測(cè)，其余成分均采用[M＋H]+進(jìn)行檢測(cè)；選用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)物性質(zhì)穩(wěn)定，檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)，且能與被測(cè)物質(zhì)完全分離；血漿樣品的處理中考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1）沉淀蛋白，結(jié)果表明選用甲醇沉淀蛋白法，內(nèi)源性物質(zhì)干擾小，基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率更佳。

藥動(dòng)學(xué)研究表明，此7個(gè)成分在正常大鼠和腦缺血再灌注損傷模型大鼠中均能在1 h內(nèi)達(dá)峰；刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間均有不同程度的縮短，表明復(fù)方麝香黃芪滴丸可以提高部分藥效成分在患病個(gè)體體內(nèi)的吸收速度；與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，復(fù)方麝香黃芪滴丸中-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的達(dá)峰時(shí)間較其他制劑均有大幅度縮短[13-17]，表明滴丸較其他傳統(tǒng)劑型可以提高藥效成分的吸收速度，達(dá)到起效迅速的目的[18]；但1 h內(nèi)取樣點(diǎn)不夠密集，藥時(shí)曲線無(wú)法看到清楚的吸收階段，有待進(jìn)一步的研究。

-藁本內(nèi)酯、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷在正常大鼠體內(nèi)符合線性藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷在模型大鼠體內(nèi)符合線性藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，說(shuō)明這些成分在相應(yīng)的生理病理狀態(tài)下，其生物半衰期與給藥劑量無(wú)關(guān)，一次給藥情況下，AUC、尿藥排泄量與給藥劑量分別成正相關(guān)[19]；在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)，各個(gè)劑量組-藁本內(nèi)酯max均較正常組明顯升高，而-藁本內(nèi)酯能呈劑量相關(guān)性地促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的核轉(zhuǎn)錄及其下游基因血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）表達(dá)，并抑制Nrf2抑制劑Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1）表達(dá)，從而減少細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平[20]，提示-藁本內(nèi)酯max升高可以更好地減少模型大鼠細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；max無(wú)明顯改變，AUC在低劑量組中明顯增加，而-藁本內(nèi)酯可以劑量相關(guān)性地提高內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，增加缺血皮質(zhì)凋亡抑制蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）的表達(dá)，并抑制Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）的活性，從而減少腦梗死體積；抑制過(guò)氧化物酶5（peroxiredoxin 5，Prx5）和Prx6表達(dá)及其下游Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)，從而減輕缺血性腦卒中的神經(jīng)元丟失、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化[20]，提示低劑量時(shí)-藁本內(nèi)酯可能通過(guò)此2種機(jī)制減少腦梗死體積，中、高劑量組AUC無(wú)明顯改變，表明腦缺血再灌注病理狀態(tài)下，-藁本內(nèi)酯吸收速度變化較小，吸收量和體內(nèi)暴露水平有所增大。芒柄花素和刺芒柄花苷在腦缺血病理狀態(tài)下吸收量和體內(nèi)暴露水平?jīng)]有明顯差異，說(shuō)明大鼠的腦缺血再灌注病理?xiàng)l件對(duì)芒柄花素和刺芒柄花苷的吸收影響不大，芒柄花素具有神經(jīng)保護(hù)和抑制炎性反應(yīng)的作用，可以對(duì)局部腦缺血進(jìn)行保護(hù)[21]，刺芒柄花苷可以通過(guò)抗自噬、抗凋亡、抗炎等對(duì)急性腦缺血發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22]。毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷和芍藥苷AUC有所降低，說(shuō)明吸收量和體內(nèi)暴露水平有所降低，但毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的半衰期有所增加，說(shuō)明其消除減慢，在體內(nèi)的滯留時(shí)間更長(zhǎng)，毛蕊異黃酮可以通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)大腦神經(jīng)元以及保護(hù)血腦屏障等作用，對(duì)腦卒中等疾病起到一定的腦保護(hù)作用[23]。復(fù)方麝香黃芪滴丸7個(gè)生物活性成分的某些藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在正常給藥和模型給藥大鼠體內(nèi)有顯著性差異，表明生理和病理狀態(tài)下機(jī)體對(duì)藥物的吸收代謝有所影響?？傮w來(lái)說(shuō)，復(fù)方麝香黃芪滴丸較傳統(tǒng)制劑可以較大提高部分藥效成分的吸收速度，在模型組中更為明顯；可以提高部分藥效成分的最大血藥濃度、生物利用度和體內(nèi)滯留時(shí)間，對(duì)缺血性腦卒中的治療可以起到顯著影響。

-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、刺芒柄花苷、苦杏仁苷和芍藥苷的max、AUC0～t相對(duì)較大，為主要的入血成分[24]。-藁本內(nèi)酯可以通過(guò)激活多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下游基因，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，挽救高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[25]，還通過(guò)抑制NOD樣受體家族3（NOD-like receptor family 3，NLRP3）炎癥小體活化和焦亡，保護(hù)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞抵抗氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷[26]；芒柄花素可以保護(hù)前腦缺血再灌注損傷中的血腦屏障并抑制神經(jīng)炎癥[27]；苦杏仁苷可以抑制低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[28]；芍藥苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥體信號(hào)通路分子的表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)；刺芒柄花苷的母核刺芒柄花素具有清除氧自由基、減少細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物、降低膽固醇等作用[29]。

總之，本研究首次對(duì)復(fù)方麝香黃芪滴丸中7個(gè)代表性藥效物質(zhì)進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究，對(duì)比分析了7個(gè)成分在正常和疾病狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律差異，為進(jìn)一步探究該制劑治療腦缺血疾病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為臨床制定科學(xué)合理的用藥策略提供一定參考意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacokinetics study of seven active ingredients of Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills in normal rats and rats with cerebral-ischemia reperfusion injury

LI Dong-hong1, XU Cui-shan1, HAN De-en1, WANG Meng-yan1, ZHANG Yun-ke2, JIA Yong-yan1, 3

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. School of Rehabilitation Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 3. Henan Research Center for Special Processing Technology of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To study the effects of seven active components (-ligustilide, formononetin, verbasin, formononetin, verbasin glucoside, amygdalin, and paeoniflorin) in Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills (復(fù)方麝香黃芪滴丸) in normal rats and rats with cerebral-ischemia reperfusion injury, and explore its difference in the pharmacokinetics.The plasma of SD rats was collected at different time points after ig Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills, plasma concentrations were determined by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS). Kinetica 5.1 pharmacokinetic software was used to calculate the pharmacokinetic parameters of seven components in each administration group, and SPSS One-way ANOVA was used to analyze whether there was a significant difference of pharmacokinetic parameters in normal rats and rats with cerebral ischemia-reperfusion injury after ig low-, medium-and high-dose Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills.Some pharmacokinetic parameters of seven bioactive components were significantly different between normal rats and rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Compared with normal group, peak concentration (max) of-ligustilide at each dose was significantly increased, area under the curve (AUC) was significantly increased at low-dose; AUC of mullein, mullein glucoside, amygdalin and paeoniflorin were decreased; Half-life of mullein and mullein glucoside were increased.It lays a foundation for further exploring the mechanism of Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills in the treatment of cerebral ischemia, and provides a reference for formulating scientific and rational drug use strategies in clinical practice.

Compound Shexiang Huangqi Dropping Pills; cerebral-ischemia reperfusion injury; pharmacokinetics;-ligustilide; formononetin; verbasin; formononetin; verbasin glucoside; amygdalin; paeoniflorin

R285.61

A

0253 - 2670(2022)15 - 4746 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.018

2022-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81974564）；中原英才計(jì)劃—科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（224200510027）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（20B360003）；河南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（2019KYCX019）

李東紅，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镏苿┬聞┬?、新技術(shù)及新藥。E-mail: 1923598428@qq.com

通信作者：賈永艷，教授，研究方向?yàn)樗幬镏苿┬聞┬?、新技術(shù)及新藥。E-mail: hnzyjyy@126.com

張運(yùn)克，教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腦血管病。E-mail: henanzyk@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]