歐陽林旗，蔣司晨，陳 鎮(zhèn)，王勝玫，何 陽，鄧桂明

烏藥揮發(fā)油對寒凝氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)及NO-sGC-cGMP信號通路的影響

歐陽林旗1, 2，蔣司晨1，陳 鎮(zhèn)1，王勝玫1, 2，何 陽1，鄧桂明1*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，湖南 長沙 410007 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208

探討烏藥揮發(fā)油對寒凝氣滯血瘀證大鼠中醫(yī)證候積分、血液流變學(xué)及一氧化氮（nitric oxide，NO）-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）-環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）信號通路的影響。將48只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及烏藥揮發(fā)油高、中、低劑量（3.76、1.88、0.94 g/kg）組和復(fù)方丹參片（1.20 g/kg）組，每組8只。除對照組外，其余組大鼠采用sc腎上腺素加冰水浴雙因素復(fù)合刺激14 d制備寒凝氣滯血瘀證模型。從造模第15天開始，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積2%聚山梨酯-80溶液，1次/d，連續(xù)7 d；在給藥過程中間隔2 d給予1次造模條件，維持大鼠血瘀證表現(xiàn)。末次給藥后的第2天對各組大鼠進(jìn)行中醫(yī)證候評分，測定各組大鼠血液流變學(xué)及血漿NO、內(nèi)皮素（endothelin，ET）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胸主動(dòng)脈組織形態(tài)；采用ELISA法檢測胸主動(dòng)脈組織中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和cGMP水平；采用Western blotting法檢測胸主動(dòng)脈組織磷酸二酯酶5A（phosphodiesterase 5A，PDE5A）和sGC蛋白表達(dá)情況。與對照組比較，模型組大鼠中醫(yī)證候積分、血液流變學(xué)（全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原）、血漿ET含量、胸主動(dòng)脈cAMP、cGMP含量、PDE5A蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；血漿NO含量和胸主動(dòng)脈sGC蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，烏藥揮發(fā)油組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)和胸主動(dòng)脈PDE5A蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），血漿NO含量、胸主動(dòng)脈cAMP和cGMP水平、sGC蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。大鼠胸主動(dòng)脈HE染色顯示，模型組大鼠血管內(nèi)膜損傷明顯、血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整、血管平滑肌細(xì)胞呈螺旋收縮樣改變；烏藥揮發(fā)油組大鼠血管內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌收縮顯著改善。烏藥揮發(fā)油能有效改善寒凝氣滯血瘀證大鼠中醫(yī)證候評分、血液流變學(xué)，發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、改善血液高凝狀態(tài)的作用，其機(jī)制與調(diào)控NO-sGC-cGMP信號通路有關(guān)。

烏藥；揮發(fā)油；氣滯血瘀證；血液流變學(xué)；磷酸二酯酶5A；一氧化氮-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸鳥苷信號通路

血瘀證是中醫(yī)臨床常見證候之一，是體內(nèi)血行遲滯或血溢脈外而停蓄體內(nèi)，以疼痛、腫塊、出血、舌紫、脈澀等為主要表現(xiàn)的證候[1]。內(nèi)傷、外感雙重刺激因素中，寒凝、氣滯是形成血瘀證的主要原因，行氣活血是血瘀證的重要治則，臨床遣方用藥常以活血化瘀為主，配伍理氣止痛、溫中散寒中藥[2]。血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究主要著眼于血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌功能、血脂及炎性標(biāo)志物、細(xì)胞化學(xué)成分含量（酶、蛋白、小分子）等方面的改變，為闡釋中藥防治血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵提供了支撐[3-4]。

烏藥為樟科山胡椒屬植物烏藥() Kosterm.的干燥塊根，為臨床常用理氣藥，有行氣止痛、溫腎散寒的功效，配伍用于血瘀證的中醫(yī)治療。烏藥主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、異喹啉類生物堿及呋喃倍半萜、黃酮類等[5-6]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調(diào)脂護(hù)肝、治療胃腸疾病等多種藥理活性[7-10]。研究表明，烏藥可影響凝血-纖溶系統(tǒng)中凝血酶與纖維蛋白原結(jié)合，延長體外凝血時(shí)間[11]；降低血漿去甲腎上腺素水平，抑制血管平滑肌細(xì)胞收縮，降低大鼠血壓[12]；烏藥葉中的槲皮苷具有良好的抗氧化和活血祛瘀作用，可顯著降低急性血瘀大鼠全血黏度[13]；烏藥中的2個(gè)倍半萜內(nèi)酯衍生物顯示出中等抗凝活性[14]。本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討烏藥藥理作用，發(fā)現(xiàn)異瑟模環(huán)烯醇、β-律草烯、母菊薁等揮發(fā)油成分可影響凝血系統(tǒng)，調(diào)節(jié)鈣離子平衡，并改善心血管功能[7]。本研究通過觀察烏藥揮發(fā)油對寒凝氣滯血瘀證模型大鼠中醫(yī)證候積分、血液流變學(xué)及一氧化氮（nitric oxide，NO）-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）-環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）信號通路的影響，探討烏藥防治血瘀證的作用機(jī)制，為臨床配伍用藥及治療心血管疾病的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，6～8周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度25 ℃，濕度45%～65%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ZYFY20181027）。

1.2 藥材

烏藥（產(chǎn)地湖南）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部張志國教授鑒定為樟科植物烏藥() Kosterm.干燥塊根，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

復(fù)方丹參片（批號20180303，0.32 g/片）購自湖南時(shí)代陽光藥業(yè)有限公司；鹽酸腎上腺素注射液（批號1801209）購自遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司；聚山梨酯-80（批號T8360）購自北京索萊寶科技有限公司；環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA試劑盒（批號CE20180728013）、cGMP ELISA試劑盒（批號CG20180725015）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）ELISA試劑盒（批號ET20180728002）購自上海晶天生物有限公司；NO檢測試劑盒（批號S0021S）購自上海碧云天生物有限公司；磷酸二酯酶5A（phosphodiesterase 5A，PDE5A）抗體（批號22624-1-AP）、sGC抗體（批號19011-1-AP）購自武漢三鷹有限公司；β-actin抗體（批號AH03275734）、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體（批號bs-0293G-HRP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號SH255495）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PIPA裂解液（批號20238）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PVDF膜（批號AS1023）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號AS1059-2）購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Rotary Microtome石蠟切片機(jī)（美國Reichert公司）；SA9000型全自動(dòng)血液流變測試儀（北京賽科希德公司）；elx800型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；BA410型生物顯微鏡（廈門Motic公司）；1645050型水平電泳儀、1704486型電泳槽、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀、Gel Doc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；L-90K型高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；5415R型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HZ-9211K型恒溫?fù)u床（江蘇易晨儀器公司）。

2 方法

2.1 烏藥揮發(fā)油的制備

本課題組前期采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法對湖南產(chǎn)烏藥揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，共鑒定了68個(gè)揮發(fā)性成分，主要為單萜類物質(zhì)，其具體含量見文獻(xiàn)報(bào)道[15]。稱取烏藥200 g，粉碎后，加入12倍量水，浸泡12 h，采用水蒸氣蒸餾法提取，藥材經(jīng)8 h加熱直至揮發(fā)油不再增加。揮發(fā)油用2%聚山梨酯-80助溶，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的溶液（以生藥量計(jì)）。

2.2 造模、分組與給藥

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取40只大鼠采用雙因素復(fù)合刺激制備寒凝氣滯血瘀證大鼠模型：大鼠sc 0.1%腎上腺素（0.8 mL/kg），2次/d，2次注射間隔4 h；第1次注射腎上腺素后2 h，將大鼠放置0～4 ℃的冰水中游泳4～8 min，連續(xù)14 d。取8只大鼠作為對照組，將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組及烏藥揮發(fā)油（3.76、1.88、0.94 g/kg）組和復(fù)方丹參片（1.2 g/kg）組，每組8只。從造模第15天開始，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積的2%聚山梨酯-80溶液，1次/d，連續(xù)7 d；在給藥過程中間隔2 d給予1次造模條件，維持大鼠氣滯血瘀證表現(xiàn)。

2.3 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠證候評分的影響

造模前后及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)中血瘀證癥狀和體征量化積分表[16]，由同一觀察者在固定角度及光線下觀察各組動(dòng)物的癥狀及體征表現(xiàn)，記錄各組動(dòng)物的癥狀及體征并予以評分。

2.4 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠血液流變學(xué)及血漿NO、ET表達(dá)的影響

末次給藥24 h后，大鼠ip水合氯醛（3 mL/kg）深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，置肝素化抗凝試管進(jìn)行全血黏度（低切變率1 s?1、中切變率30 s?1、高切變率200 s?1）和紅細(xì)胞聚集指數(shù)測定；測定完成后全血經(jīng)25 ℃、3000 r/min離心10 min，取血漿測定血漿黏度及纖維蛋白原，所有樣本在4 h內(nèi)檢測完畢。另取1 mL全血于枸櫞酸鈉真空采血管中靜置1 h后，4 ℃、3000 r/min離心15 min，分離上層血漿，按試劑盒說明書分別采用硝酸還原酶法和ELISA法分別檢測血漿中NO、ET水平。

2.5 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)的影響

取大鼠胸主動(dòng)脈3～5 mm組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、貼片、烤片后，進(jìn)行脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，置于顯微鏡下觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈的細(xì)胞形態(tài)。

2.6 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈cAMP、cGMP含量的影響

稱取大鼠胸主動(dòng)脈組織50 mg，加入2 mL醋酸緩沖液（pH 4.75），冰浴下組織勻漿，加入2 mL無水乙醇，混合均勻，靜置5 min，3500 r/min離心15 min，取上清液；加入2 mL 75%乙醇洗沉淀，勻漿分散后，3500 r/min離心15 min，合并2次離心后的上清液，置于烘箱中60 ℃烘干，留取殘?jiān)? ℃保存，測量時(shí)用0.5 mL醋酸緩沖液溶解，按ELISA試劑盒說明書檢測大鼠胸主動(dòng)脈組織中cAMP、cGMP含量。

2.7 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈PDE5A和sGC蛋白表達(dá)的影響

稱取大鼠胸主動(dòng)脈組織，用液氮迅速充分研磨，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，靜置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，100 ℃加熱變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉60 min；分別加入PDE5A抗體（1∶1000）、sGC抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體（1∶1000），室溫孵育60 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析條帶。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠證候評分的影響

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)，各組大鼠毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，飲食及二便均正常，舌質(zhì)紅潤，耳廓紅白相間，爪甲光澤有力，尾部淡紅。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與對照組比較，模型組大鼠均出現(xiàn)蜷縮不動(dòng)、弓背豎毛的癥狀，進(jìn)食量明顯減少、體質(zhì)量增長緩慢，毛色枯槁，墊料需每天更換，大便增多、質(zhì)地軟、不成形，并出現(xiàn)明顯舌質(zhì)暗紫，口唇、耳廓及尾部青紫、暗紫及暗紅等體征，如表1所示，證候積分顯著增加（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠證候積分明顯降低（＜0.01），其中烏藥揮發(fā)油高劑量組證候積分改善最為明顯。

表1 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠證候量化積分的影響(, n = 8)

Table 1 Effect of volatile oil from Linderae Radix on quantitative integral table of symptoms and signs in rats with qi stagnation and blood stasis syndrome (, n = 8)

表1 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠證候量化積分的影響(, n = 8)

組別劑量/(g·kg?1)量化積分嚴(yán)重程度 對照—0.00±0.00無 模型—17.50±0.53##重度 烏藥揮發(fā)油3.767.38±0.74**輕度 1.8811.63±0.52**中度 0.9412.75±1.75**中度 復(fù)方丹參片1.2011.50±1.60**中度

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.2 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠血液流變學(xué)及血漿NO和ET水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)全血黏度（高、中、低切變率）、血漿黏度、血漿纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，烏藥揮發(fā)油高劑量組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著降低（＜0.01）；烏藥揮發(fā)油中劑量組大鼠低切變率、血漿黏度、FIB和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）；烏藥揮發(fā)油低劑量組大鼠低切變率、FIB和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（＜0.05）；復(fù)方丹參片組大鼠全血黏度、FIB降低和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）。如圖1所示，與對照組比較，模型組血漿NO水平顯著降低（＜0.01），血漿ET水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血漿NO水平均顯著增高，ET水平顯著降低（＜0.01）。

表2 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響(, n = 8)

Table 2 Effect of volatile oil from Linderae Radix on hemorheology in rats with qi stagnation and blood stasis syndrome (, n = 8)

表2 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響(, n = 8)

組別劑量/(g·kg?1)全血黏度（切變率 s?1）血漿黏度/(mPa·s)FIB/(g·L?1)紅細(xì)胞聚集指數(shù) 高切（200 s?1）中切（30 s?1）低切（1 s?1） 對照—4.35±0.406.32±0.3615.01±0.793.38±0.197.44±0.384.62±0.58 模型—6.74±0.79##9.22±0.82##19.64±0.98##4.06±0.29##9.14±0.74##8.50±1.46## 烏藥揮發(fā)油3.764.58±0.72**7.20±1.60**15.82±1.03**3.57±0.32**7.51±1.48**6.32±0.82** 1.885.89±0.638.86±1.4516.46±1.15**3.73±0.27*8.09±0.77*6.88±0.89** 0.946.40±2.578.47±1.5417.42±1.57*3.89±0.348.14±0.71*6.96±1.95* 復(fù)方丹參片1.205.23±0.45*7.67±1.32*16.56±3.79**3.78±0.437.97±1.25*6.46±0.75**

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜凹凸不平、血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落嚴(yán)重，血管平滑肌細(xì)胞呈螺旋收縮樣改變，提示動(dòng)脈血管存在持續(xù)收縮狀態(tài)；與模型組比較，烏藥揮發(fā)油高劑量組大鼠血管內(nèi)膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損狀態(tài)恢復(fù)，血管平滑肌細(xì)胞明顯舒張；烏藥揮發(fā)油低、中劑量組大鼠血管內(nèi)膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷部分恢復(fù)，血管平滑肌細(xì)胞舒張；復(fù)方丹參片組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷狀態(tài)基本恢復(fù)，血管平滑肌細(xì)胞舒張。

3.4 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈cAMP和cGMP含量的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中cAMP和cGMP含量顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，烏藥揮發(fā)油高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠胸主動(dòng)脈cAMP和cGMP含量顯著升高（＜0.01）；烏藥揮發(fā)油中劑量組大鼠胸主動(dòng)脈cGMP含量顯著升高（＜0.05）。

圖2 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化的影響(HE, ×100)

圖3 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠胸主動(dòng)脈組織cAMP和cGMP含量的影響(, n = 8)

3.5 烏藥揮發(fā)油對模型大鼠胸主動(dòng)脈PDE5A和sGC蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織PDE5A蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），sGC蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，烏藥揮發(fā)油中、高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠PDE5A蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），烏藥揮發(fā)油高劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠sGC蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖4 烏藥揮發(fā)油對氣滯血瘀證大鼠胸主動(dòng)脈組織PDE5A和sGC蛋白表達(dá)的影響(, n = 8)

4 討論

血瘀證常夾雜多種證候出現(xiàn)，造模時(shí)需將病因病機(jī)與證候結(jié)合，常選擇多因素復(fù)合刺激復(fù)制血瘀證模型[17]。寒凝、氣滯均是形成血瘀證的主要原因，采用注射腎上腺素及冰水浴雙因素復(fù)合刺激，模擬精神因素和“寒邪”侵襲共同作用，可體現(xiàn)血瘀證患者血液流變學(xué)的黏、濃、凝、聚的特性，模型動(dòng)物均觀察到血液流變學(xué)、組織形態(tài)等明顯變化[18-19]。周華妙等[16]提出注重血瘀證模型的外部表征（癥狀和體征特點(diǎn)），總結(jié)了寒凝血瘀證的證候群，并將其量化評分，評價(jià)寒凝血瘀小鼠的證候程度。本研究中模型大鼠血瘀證癥狀典型，符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17-19]；參考上述癥狀和體征量化評分表，比較各組大鼠中醫(yī)證候積分，烏藥揮發(fā)油可顯著改善寒凝氣滯血瘀證大鼠證候積分，提示其對血瘀證具有防治作用。文獻(xiàn)報(bào)道的血瘀證研究，絕大多數(shù)在造模成功后停止“腎上腺素＋冰水浴”雙因素的造模條件刺激，再給予藥物等干預(yù)因素，基本排除造模因素對實(shí)驗(yàn)的影響。本研究在停止造模因素后給予烏藥揮發(fā)油干預(yù)，HE染色結(jié)果顯示，烏藥揮發(fā)油可改善大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷狀態(tài)、舒張血管平滑肌。Shimomura等[12]發(fā)現(xiàn)烏藥可降低血漿去甲腎上腺素水平，降低收縮壓，改善自發(fā)性高血壓大鼠心臟功能，由此推測烏藥揮發(fā)油是否通過降低血漿或胸主動(dòng)脈組織中去甲腎上腺素水平發(fā)揮舒張胸主動(dòng)脈血管平滑肌的作用，仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

血瘀證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)關(guān)注其引起血液流變學(xué)、生化以及組織形態(tài)學(xué)方面的改變[3,20]。臨床也常將血液流變學(xué)作為血瘀證的一種客觀評價(jià)指標(biāo)，其中全血黏度越高，流動(dòng)性越小，低切變率（1 s?1）下的全血黏度反映紅細(xì)胞聚集能力，高切變率（200 s?1）下的全血黏度反映紅細(xì)胞變形能力；兩者比值為紅細(xì)胞聚集指數(shù)，聚集指數(shù)越高，血液流動(dòng)性越小[21]。血漿黏度主要取決于血漿纖維蛋白原等生物大分子物質(zhì)的水平變化，兩者呈正相關(guān)，血漿黏度增加反映瘀血存在。本實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠出現(xiàn)明顯血液流變學(xué)異常，全血黏度、血漿黏度、FIB、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高，烏藥揮發(fā)油可顯著改善血液流變學(xué)指標(biāo)，說明烏藥揮發(fā)油可通過抑制血細(xì)胞聚集、降低血漿中纖維蛋白原等生物大分子物質(zhì)水平，從而起到抑制血液“濃”和“黏”的作用，并對紅細(xì)胞變形能力也有明顯影響。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管壁完整性方面起著重要作用，血瘀證與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙具有相關(guān)性，其合成、釋放多種活性物質(zhì)如ET、NO，參與血管舒縮、血栓形成等過程的調(diào)節(jié)[22]。本研究結(jié)果顯示，烏藥揮發(fā)油可顯著增加血漿NO含量，降低ET含量，提示其可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，維持血管舒張/收縮平衡，改善血瘀證大鼠“血流瘀阻”，保持正常血液流動(dòng)。cAMP、cGMP可調(diào)節(jié)血小板內(nèi)鈣離子濃度，影響血小板聚集，與血液高凝狀態(tài)和微循環(huán)障礙密切相關(guān)，cAMP生成減少或cGMP生成增多時(shí)，促進(jìn)血小板聚集，反之抑制血小板聚集[23]。本研究在模型大鼠胸主動(dòng)脈組織中觀察到cAMP、cGMP含量均顯著下降，高劑量烏藥揮發(fā)油可顯著增加兩者含量，提示模型大鼠胸主動(dòng)脈組織中cGMP作用相較于cAMP強(qiáng)，對血小板聚集可能發(fā)揮主要作用，改善血液高凝狀態(tài)。血漿NO進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞中與sGC結(jié)合，促進(jìn)cGMP轉(zhuǎn)化，并在細(xì)胞中被PDE水解[24]，NO-sGC-cGMP信號通路是血管內(nèi)皮功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，與血管損傷修復(fù)密切相關(guān)[25-26]。因此，本研究進(jìn)一步觀察了胸主動(dòng)脈組織中sGC、PDE5A蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示高劑量烏藥揮發(fā)油顯著增加sGC蛋白表達(dá)水平，降低PDE5A蛋白表達(dá)水平。烏藥揮發(fā)油可顯著提高血漿中NO和胸主動(dòng)脈中cGMP含量，通過增加sGC蛋白表達(dá)提高cGMP含量，同時(shí)減少其通過PDE5A的降解，提示烏藥揮發(fā)油可能通過調(diào)控NO-sGC-cGMP信號通路，發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)烏藥揮發(fā)油能夠改善寒凝氣滯血瘀證模型大鼠中醫(yī)證候積分、胸主動(dòng)脈組織形態(tài)、血液流變學(xué)指標(biāo)，增加血漿NO含量、降低ET含量，提高胸主動(dòng)脈cAMP、cGMP含量，調(diào)控NO-sGC-cGMP信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，改善寒凝氣滯血瘀大鼠血管舒縮功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善血液高凝狀態(tài)，證實(shí)了理氣藥烏藥配伍用于血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵，為其在血瘀證中醫(yī)防治方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of volatile oil fromon hemorheology and NO-sGC-cGMP signaling pathway in rats with qi stagnation and blood stasis syndrome

OUYANG Lin-qi1, 2, JIANG Si-chen1, CHEN Zhen1, WANG Sheng-mei1, 2, HE Yang1, DENG Gui-ming2

1. Department of Pharmacy, The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China 2. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To observe the effect of volatile oil from Wuyao () on hemorheology and nitric oxide (NO)-soluble guanylate cyclase (sGC)-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) signaling pathway in rats with coldstagnation and blood stasis syndrome (QSBSS).Forty-eight SD male rats were randomly divided into control group, model group, volatile oil fromhigh-, medium-, low-dose (3.76, 1.88, 0.94 g/kg) groups and Fufangdanshen tablets (1.2 g/g) group, with eight rats in each group. Except control group, rats of QSBSS model were prepared by two-factor stimulation of sc adrenaline plus ice water bath for 14 d. Starting from the 15th day of modeling, each administration group was ig corresponding drug, control group and model group were ig 2% tween-80 solution, once a day for 7 d. During the administration process, the modeling condition was given once at an interval of 2 d to maintain the manifestation of blood stasis in rats. On the 2nd day after the last administration, rats in each group were scored for TCM syndromes, and hemorheology, plasma NO and endothelin (ET) levels of rats in each group were determined; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphology of thoracic aorta; Levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cGMP in thoracic aortic tissues were determined by ELISA; Phosphodiesterase 5A (PDE5A) and sGC protein expressions in thoracic aortic tissues were detected by Western blotting.Compared with control group, TCM syndrome score, blood rheology (whole blood viscosity, plasma viscosity, erythrocyte aggregation index, fibrinogen), plasma ET level, PDE5A protein expression in thoracic aorta were significantly higher in model group (< 0.01), plasma NO levels, cAMP and cGMP contents, sGC protein expression in thoracic aorta were significantly lower (< 0.01). Compared with model group, rats in volatile oil fromgroup showed lower TCM syndrome score, blood rheological indexes, plasma ET levels, PDE5A protein expression in thoracic aorta (< 0.05, 0.01), while significantly higher plasma NO levels, cAMP and cGMP contents, sGC protein expression in thoracic aorta (< 0.05, 0.01). HE staining of rat thoracic aorta showed that vascular intima of rats in model group was significantly damaged, vascular endothelial cells were incomplete, and vascular smooth muscle cells showed spiral contraction-like changes. The damage of vascular intima and vascular endothelial cells, contraction of vascular smooth muscle were significantly improved in volatile oil fromgroup.Volatile oil fromcan effectively improve the TCM syndrome score and blood rheology in rats with QSBSS, and exert the effect of vascular endothelial cell protection and improving blood hypercoagulation, and its mechanism is related to the regulation of NO-sGC-cGMP signaling pathway.

; volatile oil;stagnation and blood stasis syndrome; hemorheology; phosphodiesterase 5A; NO-sGC-cGMP signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)15 - 4730 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.016

2022-04-04

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018JJ6040，2020JJ5434）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（201986，2021016）；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（19A372）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)一流學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（2018YX05）

歐陽林旗（1985—），男，碩士，副主任藥師，從事臨床中藥學(xué)研究。Tel: (0731)85369137 E-mail: oylq03@163.com

通信作者：鄧桂明，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與臨床中藥學(xué)研究。E-mail: guimingd1004@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]