賈志鑫，潘明霞，劉力榕，朱美霞，方 聰，于智穎，劉 潔，李月婷2, ，肖紅斌*

基于代謝組學(xué)的速效救心丸抗心肌缺血作用機(jī)制研究

賈志鑫1, 2，潘明霞3，劉力榕3，朱美霞3，方 聰3，于智穎3，劉 潔1, 2，李月婷2, 3，肖紅斌1, 2*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

研究速效救心丸對(duì)心肌缺血大鼠的保護(hù)作用及對(duì)血漿代謝物的影響，初步探討其干預(yù)心肌缺血的代謝途徑和可能機(jī)制。采用垂體后葉素建立大鼠心肌缺血模型，通過(guò)病理組織切片和肌酸激酶（creatine kinase，CK）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、羥丁酸脫氫酶（hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）生化指標(biāo)評(píng)估速效救心丸對(duì)心肌缺血大鼠的保護(hù)作用；采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QTOF/MS）技術(shù)對(duì)血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究，篩選潛在生物標(biāo)志物并富集代謝通路。速效救心丸可明顯改善心肌缺血大鼠心臟組織病理變化；顯著降低血漿CK、AST、HBDH、LDH活性（＜0.05、0.01），升高SOD活性（＜0.05、0.01）。代謝組學(xué)分析共篩選到39個(gè)潛在生物標(biāo)志物，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酰胺和谷氨酸代謝等7條通路。速效救心丸能夠有效改善模型大鼠的心肌缺血損傷，可能通過(guò)影響能量代謝及鞘脂代謝等相關(guān)通路發(fā)揮作用。

速效救心丸；心肌缺血；代謝組學(xué)；潛在生物標(biāo)志物；能量代謝；鞘脂代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；三羧酸循環(huán)

心肌缺血是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑闹饕憩F(xiàn)[1]。我國(guó)居民由冠心病引起的死亡占疾病死亡構(gòu)成的40%以上，嚴(yán)重危害生命安全[2]；急性或持續(xù)心肌缺血可引起急性心肌梗死，并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，危害人類健康[3]。因此，抗心肌缺血藥物的作用機(jī)制研究是備受關(guān)注的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

速效救心丸是由川芎和冰片等制成的滴丸型中成藥，川芎辛、溫，歸肝經(jīng)，冰片辛、苦，微寒，歸心脾肺經(jīng)。2味藥合用可充分發(fā)揮辛香走竄之力，起到行氣活血、祛瘀止痛、活血化瘀、開(kāi)竅醒神的功效[4]。速效救心丸臨床常用于改善冠心病患者心肌缺血狀態(tài)、緩解心絞痛等癥狀，其起效快、療效顯著且無(wú)明顯不良反應(yīng)[5-7]。研究表明，速效救心丸治療冠心病心絞痛的療效優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸（同等強(qiáng)度活動(dòng)心絞痛發(fā)作頻率減少，心電圖ST-T段顯著改善，2種藥相比有顯著性差異），且成本較低[8]；針對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者改善血液流變學(xué)異常的作用強(qiáng)于消心痛（如全血黏度、血漿黏度、血小板黏附率等指標(biāo)均有顯著性差異），且無(wú)明顯不良反應(yīng)[9]。目前，關(guān)于速效救心丸的研究主要集中在化學(xué)成分、體內(nèi)成分含量測(cè)定等方面，其作用機(jī)制研究涉及擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善再灌注損傷和促進(jìn)血管新生等[10-12]。由此可見(jiàn)，速效救心丸發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探索，有關(guān)其對(duì)體內(nèi)代謝物輪廓的調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

代謝組學(xué)把機(jī)體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來(lái)研究，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，其研究思路與中醫(yī)藥的整體觀和辨證論治特點(diǎn)吻合，為中藥復(fù)雜系統(tǒng)研究和新藥研發(fā)提供了有力手段[13]。隨著對(duì)復(fù)雜機(jī)體認(rèn)識(shí)的逐步深入，代謝組學(xué)研究逐步從潛在標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到代謝機(jī)制的研究，通過(guò)代謝通路的富集探討可能的作用通路，為作用機(jī)制研究提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。本研究采用垂體后葉素（pituitrin，Pit）制備大鼠心肌缺血模型，通過(guò)組織病理學(xué)及生化指標(biāo)評(píng)價(jià)造模情況及速效救心丸藥效，并基于超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QTOF/MS）技術(shù)對(duì)血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究，篩選潛在生物標(biāo)志物、富集代謝通路，分析速效救心丸對(duì)生物標(biāo)志物的調(diào)控作用及可能機(jī)制，以期為速效救心丸抗心肌缺血作用機(jī)制的闡明提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±5）g，6周齡，購(gòu)自維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）-2016-0011。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照飼養(yǎng)和使用指南進(jìn)行，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2021083102-3044）。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物晝夜節(jié)律正常，并保證其自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥品與試劑

速效救心丸（40 mg/粒，批號(hào)619350）購(gòu)自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；Pit（批號(hào)20210811）購(gòu)自中大獸藥有限責(zé)任公司；羧甲基纖維素鈉（批號(hào)S14016）、水合氯醛（批號(hào)S24149）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；LC-MS級(jí)乙腈、HPLC級(jí)甲醇購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

Agilent iFunnel 6550 Q-TOF LC/MS四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等（美國(guó)Agilent公司）；AU480型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；AT201型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水制備儀（德國(guó)Millipore公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 藥物的配制

速效救心丸研磨后過(guò)100目篩，用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成質(zhì)量濃度分別為7.56、15.1 mg/mL的混懸液用于大鼠ig給藥；配制質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的水合氯醛用于大鼠ip麻醉。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、模型組和速效救心丸低、高劑量（75.6、151.0 mg/kg，分別相當(dāng)于臨床1、2倍劑量）組，每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)7 d。第7天給藥后0.5 h，模型組和各給藥組ip Pit造模（10 mL/kg）。

2.3 樣本收集

造模后3 h進(jìn)行血漿及心臟樣本的收集。大鼠ip水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg）后，腹主動(dòng)脈取血，置于肝素鈉潤(rùn)過(guò)的離心管中，3500 r/min離心15 min，取上清即得血漿。用生理鹽水灌流心臟后取心臟，用多聚甲醛固定用于組織病理學(xué)分析。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)及組織病理學(xué)

利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血漿中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、羥丁酸脫氫酶（hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性。

采用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色法對(duì)靶器官心臟進(jìn)行染色，觀察造模前后及藥物對(duì)大鼠心臟的影響。取多聚甲醛固定的心臟，經(jīng)過(guò)脫水、包埋、切片、染色后，將其置于光學(xué)顯微鏡下觀察，并對(duì)主要部位進(jìn)行拍照。

2.5 代謝組學(xué)分析

2.5.1 樣品前處理 分別取各組血漿樣品200 μL解凍，加入600 μL冷乙腈，渦旋30 s沉淀蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液真空濃縮。加入100 μL 10%乙腈溶液，超聲溶解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

分別取對(duì)照組、模型組和給藥組血漿樣品各20 μL均勻混合，得到混合血漿樣品，記為質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品前處理方法與血漿樣品前處理方法相同。每進(jìn)樣分析10個(gè)樣品后分析1次質(zhì)控樣品，用于評(píng)估液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)序列樣本分析的穩(wěn)定性。

2.5.2 UHPLC-QTOF/MS分析

（1）色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，5%～45% B；5～8 min，45%～80% B；8～10 min，80%～95% B；10～18 min，95% B；18～20 min，95%～5% B；20～22 min，5% B；進(jìn)樣量為正離子模式10 μL，負(fù)離子模式5 μL；柱溫為35 ℃；體積流量為0.3 mL/min。

（2）質(zhì)譜條件：正離子模式：干燥氣溫度為225 ℃；干燥氣體積流量為15 L/min；噴霧氣壓力為241.325 kPa；鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣體積流量為11 L/min；噴嘴電壓為1500 V；毛細(xì)管出口電壓為380 V；毛細(xì)管電壓為4000 V；質(zhì)譜掃描范圍50～1200。負(fù)離子模式：干燥氣溫度為225 ℃；干燥氣體積流量為15 L/min；噴霧氣壓力為241.325 kPa；鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣體積流量為11 L/min；噴嘴電壓為1500 V；毛細(xì)管出口電壓為380 V；毛細(xì)管電壓為3500 V；質(zhì)譜掃描范圍50～1400。

2.5.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 將采集到的UHPLC-QTOF/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入Profinder，對(duì)譜圖進(jìn)行峰的發(fā)現(xiàn)、對(duì)齊、濾過(guò)及歸一化等操作，導(dǎo)出CEF文件及CSV文件。利用安捷倫Mass Profiler Professional（MPP）軟件對(duì)導(dǎo)出的CEF文件數(shù)據(jù)進(jìn)行批處理，比較模型組與對(duì)照組，速效救心丸中、高劑量組與模型組之間的差異。通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行多組之間的比較，并以＜0.05、fold change＞2為篩選條件得到差異代謝物。與此同時(shí)，利用SIMCA-P 14.0軟件對(duì)導(dǎo)出的CSV文件數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交-偏最小二乘法-判別分析（orthogonal- partial least squares- discriminant analysis，OPLS-DA），獲取變量重要性投影值（variable importance for projectio，VIP）值，進(jìn)一步篩選VIP＞1且|(corr)|≥0.58的差異代謝物為潛在生物標(biāo)志物[14-16]。

利用MPP軟件中的ID Browser對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行化合物鑒別，根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)如Metlin（http://metlin.scripps.edu）、HMDB（http://www. hmdb.ca）等進(jìn)行化合物鑒定，匹配得到潛在生物標(biāo)志物名稱、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路ID等信息。運(yùn)用MetaboAnalyst 5.0（https://www. metaboanalyst.ca/）平臺(tái)對(duì)篩選得到的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行富集，獲取速效救心丸調(diào)控心肌缺血的可能代謝通路。

采用IBM SPSS Statistics 26對(duì)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以表示含量及偏差，并采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 速效救心丸對(duì)心肌缺血模型大鼠生化指標(biāo)的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿中CK、LDH、AST和HBDH活性均顯著升高（＜0.05、0.01），SOD活性顯著降低（＜0.05）；各給藥組血漿中CK、LDH、AST和HBDH活性均顯著降低（＜0.05、0.01），SOD活性顯著升高（＜0.05、0.01）。

C-對(duì)照組 M-模型組 DL-速效救心丸低劑量組 DH-速效救心丸高劑量組，下圖同 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.2 速效救心丸對(duì)心肌缺血大鼠心臟組織病理的影響

如圖2所示，對(duì)照組大鼠心臟心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，組織形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列正常，未見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)或壞死；模型組大鼠心臟出現(xiàn)大量的炎癥浸潤(rùn)，胞質(zhì)疏松淡染，局部心肌纖維排列不規(guī)則，可見(jiàn)心肌細(xì)胞死亡；各給藥組上述病理變化明顯改善，且以速效救心丸高劑量組作用最佳。組織病理學(xué)及生化指標(biāo)結(jié)果表明SD大鼠心肌缺血模型制備成功，速效救心丸具有顯著的心臟保護(hù)作用，且高劑量組的改善效果較低劑量組更為明顯。

圖2 速效救心丸對(duì)心肌缺血大鼠心臟組織病理變化的影響 (HE, ×100)

3.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)過(guò)Profinder對(duì)譜圖進(jìn)行處理后得到6198個(gè)離子。將所有離子數(shù)據(jù)導(dǎo)出CSV文件并導(dǎo)入SIMCA-P軟件，采用無(wú)監(jiān)督模式的PCA對(duì)各組進(jìn)行代謝輪廓的整體分析，反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)。結(jié)果表明，正、負(fù)離子模式下模型組與對(duì)照組能夠明顯分開(kāi)，速效救心丸低、高劑量組均能與模型組顯著分開(kāi)（圖3-A、B）。即造模對(duì)大鼠內(nèi)源性代謝物產(chǎn)生了擾動(dòng)，而速效救心丸能夠緩解這種改變。進(jìn)一步采用OPLS-DA對(duì)2組之間進(jìn)行有監(jiān)督的分析比較，發(fā)現(xiàn)正、負(fù)離子模式下，模型組與對(duì)照組、速效救心丸中劑量組與模型組、速效救心丸高劑量組與模型組之間均能很好地分離（圖3-C～H）。OPLS-DA模型通過(guò)2、2和2進(jìn)行可靠性判斷并分析是否存在過(guò)擬合。正離子模式下，模型組與對(duì)照組、速效救心丸低劑量組與模型組、速效救心丸高劑量組與模型組的上述指標(biāo)分別為2＝0.272，2＝0.986，2＝0.922；2＝0.369，2＝0.989，2＝0.856；2＝0.408，2＝0.991，2＝0.966。負(fù)離子模式下，上述指標(biāo)分別為2＝0.441，2＝0.994，2＝0.879；2＝0.304，2＝0.982，2＝0.775；2＝0.399，2＝0.998，2＝0.963。采用置換檢驗(yàn)進(jìn)行OPLS-DA模型驗(yàn)證，經(jīng)200次置換檢驗(yàn)得到的結(jié)果見(jiàn)圖4，所有模擬值均低于最右側(cè)真實(shí)值，且2的回歸線截距均小于0.05。以上結(jié)果表明模型具有良好的擬合度和預(yù)測(cè)能力，且不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

3.4 分析方法穩(wěn)定性檢測(cè)

采用無(wú)監(jiān)督模式的PCA對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有質(zhì)控樣本都在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)（圖5）。表明該方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，本次實(shí)驗(yàn)所獲取的數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3.5 潛在生物標(biāo)志物篩選

為獲得與速效救心丸抗心肌缺血作用機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物，根據(jù)“2.5.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行潛在生物標(biāo)志物的篩選（＜0.05、fold change＞2、VIP＞1且|(corr)|≥0.58），并利用多種軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物的匹配，結(jié)合高分辨數(shù)據(jù)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)信息綜合確認(rèn)潛在生物標(biāo)志物。共篩選得到39個(gè)潛在生物標(biāo)志物（表1）。對(duì)典型的血漿潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行分析并繪制不同組別的相對(duì)峰面積比較圖（圖6）。與對(duì)照組相比，模型大鼠血漿中谷氨酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、神經(jīng)酰胺（d18∶1/12∶0）、鞘氨醇、葡萄糖胺-6-磷酸、植物鞘氨醇、氧化谷胱甘肽含量升高，而速效救心丸能夠降低這些代謝物的含量；α-酮戊二酸、草酰乙酸、富馬酸、1-磷酸鞘氨醇升高，而速效救心丸能夠回調(diào)這些代謝物。

A、B-正、負(fù)離子模式下的PCA得分圖 C、D-正、負(fù)離子模式下，模型組與對(duì)照組OPLS-DA得分圖 E、F-正、負(fù)離子模式下，速效救心丸低劑量組與模型組OPLS-DA得分圖 G、H-正、負(fù)離子模式下，速效救心丸高劑量組與模型組OPLS-DA得分圖

A、B-正、負(fù)離子模式下，模型組與對(duì)照組OPLS-DA置換驗(yàn)證結(jié)果 C、D-正、負(fù)離子模式下，速效救心丸低劑量組與模型組OPLS-DA置換驗(yàn)證結(jié)果 E、F-正、負(fù)離子模式下，速效救心丸高劑量組與模型組OPLS-DA置換驗(yàn)證結(jié)果

圖5 正 (A)、負(fù)離子模式 (B) 下質(zhì)控樣本PCA得分圖

對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行熱圖分析（圖7），水平軸代表各組樣本，垂直軸代表潛在生物標(biāo)志物，顏色深淺代表相對(duì)峰面積的高低（紅棕色表示高，藍(lán)色表示低）。從熱圖中可看出血漿中潛在生物標(biāo)志物的含量區(qū)分明顯，直觀地表現(xiàn)了這些潛在生物標(biāo)志物具有較好的判別能力。

表1 與速效救心丸抗心肌缺血相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物

3.6 代謝通路分析

將篩選得到的39個(gè)潛在生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst平臺(tái)進(jìn)行代謝通路富集，以代謝通路影響值impact value＞0.1和代謝通路顯著性水平＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共得到7條與速效救心丸抗心肌缺血作用機(jī)制密切相關(guān)的代謝通路（圖8），分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酰胺和谷氨酸代謝、鞘脂代謝、精氨酸生物合成、組氨酸代謝、生物素代謝。顯著性排名前3的代謝通路涉及能量代謝相關(guān)的三羧酸循環(huán)以及氨基酸代謝（谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸）等，排名第4的為鞘脂代謝相關(guān)通路，提示速效救心丸抗心肌缺血可能與能量代謝調(diào)控和鞘脂代謝調(diào)控有關(guān)。

圖6 速效救心丸干預(yù)心肌缺血大鼠血漿代謝物的典型差異表達(dá)

圖7 不同組別潛在生物標(biāo)志物的熱圖分析

圖8 潛在生物標(biāo)志物代謝通路的富集

4 討論

本研究以心肌缺血模型大鼠為研究對(duì)象，探討速效救心丸抗心肌缺血的作用機(jī)制。通過(guò)組織病理學(xué)、生化指標(biāo)分析等對(duì)造模情況及速效救心丸藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)利用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)大鼠血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選潛在生物標(biāo)志物，富集代謝通路，探究其作用機(jī)制。本研究共鑒定出39種與心肌缺血密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，速效救心丸能夠顯著回調(diào)這些潛在生物標(biāo)志物。代謝通路分析表明，速效救心丸主要通過(guò)調(diào)節(jié)涉及能量代謝相關(guān)的三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝（如谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸）以及鞘脂代謝等途徑發(fā)揮作用（圖9）。

Pit可誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣進(jìn)而引起心肌缺血，所制備的大鼠急性心肌缺血模型與臨床中變異性心絞痛的發(fā)病過(guò)程相似，被廣泛應(yīng)用于抗心肌缺血藥物的篩選[17-18]。心肌缺血的發(fā)生導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，引起細(xì)胞膜通透性改變，造成多種酶體、蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物大量釋放進(jìn)入血液，其中CK、LDH、AST、HBDH是衡量心肌受損的重要標(biāo)志物[19-21]。本研究中模型組大鼠上述標(biāo)志物活性顯著升高，反映了造模對(duì)大鼠心臟造成了損傷；而給予速效救心丸后上述標(biāo)志物活性顯著下降，表明速效救心丸對(duì)心肌缺血大鼠具有心臟保護(hù)作用。SOD是活性氧清除劑，能將體內(nèi)超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，再經(jīng)過(guò)其他酶作用轉(zhuǎn)化為水，能夠反映機(jī)體承受氧化應(yīng)激的程度[22-23]。本研究中造模后大鼠血漿中SOD活性降低，表明模型組大鼠發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷；給藥后SOD活性顯著升高，表明速效救心丸可有效減輕氧化應(yīng)激。

心臟是為循環(huán)系統(tǒng)提供動(dòng)力的器官，心臟的持續(xù)工作需要足夠的能量來(lái)實(shí)現(xiàn)，而心肌缺血最直接的影響是能量代謝受損[24-25]。三羧酸循環(huán)是能量代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在此過(guò)程中，葡萄糖通過(guò)糖酵解生成丙酮酸并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進(jìn)入循環(huán)，該循環(huán)產(chǎn)生的活性氫最終經(jīng)過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），是有氧呼吸最主要的供能方式[26-27]。造模后，三羧酸循環(huán)中涉及到的關(guān)鍵代謝物α-酮戊二酸、富馬酸、草酰乙酸含量顯著降低，檸檬酸、蘋(píng)果酸含量顯著升高，表明心肌缺血模型破壞了三羧酸循環(huán)的穩(wěn)態(tài)，干擾了能量供應(yīng)。速效救心丸顯著回調(diào)了上述潛在生物標(biāo)志物，表明速效救心丸可能通過(guò)干預(yù)上述化合物維持三羧酸循環(huán)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保證活性氫的產(chǎn)生，維持心肌缺血情況下的能量供應(yīng)。

心肌缺血直接導(dǎo)致機(jī)體血流量下降，葡萄糖供應(yīng)不足[28]。因此，調(diào)動(dòng)可以利用的碳源對(duì)能量代謝的維持至關(guān)重要[29]。除葡萄糖外，氨基酸途徑是能量代謝重要的碳源供應(yīng)[30]。谷氨酸是氨基酸能量代謝途徑的一種底物，可經(jīng)由谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下生成，并能通過(guò)生成α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，獨(dú)立于葡萄糖為三羧酸循環(huán)供能[31]。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，草酰乙酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、谷氨酸和谷氨酰胺-6-磷酸的含量均發(fā)生了明顯改變，且速效救心丸能夠回調(diào)這種改變。表明速效救心丸可能通過(guò)調(diào)動(dòng)能量代謝的碳源供應(yīng)來(lái)彌補(bǔ)葡萄糖缺失造成的能量供應(yīng)不足，進(jìn)而維持能量代謝，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

由以上可知，速效救心丸對(duì)能量代謝的調(diào)控涉及三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝等多個(gè)途徑，可能是其有效成分進(jìn)入體內(nèi)后，通過(guò)作用于潛在生物標(biāo)志物的關(guān)鍵酶在多條代謝通路發(fā)揮其調(diào)控作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)心肌缺血大鼠心臟的保護(hù)效果，與中藥多靶點(diǎn)、多途徑的作用特色相吻合[32]。

綠色代表潛在生物標(biāo)志物模型組較對(duì)照組下調(diào)，給予速效救心丸后上升；紅色代表潛在生物標(biāo)志物模型組較對(duì)照組上調(diào)，給予速效救心丸后下降

鞘脂類化合物廣泛存在于各種生物體中，是細(xì)胞膜的主要成分，也是細(xì)胞中多種信號(hào)傳導(dǎo)的重要因子，參與細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)和凋亡等過(guò)程[33]。也有研究表明，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的堆積是誘發(fā)細(xì)胞凋亡、引起器官功能障礙的重要因素[34]。研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇能夠通過(guò)降低細(xì)胞收縮力誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；植物鞘氨醇能夠通過(guò)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、釋放細(xì)胞色素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。1-磷酸鞘氨醇的信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)了血管生成、血管通透性和血管張力等重要的血管功能[36-37]，其受體在維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能和血管張力等方面發(fā)揮重要作用[38]。造模后血漿中鞘氨醇、植物鞘氨醇和神經(jīng)酰胺（d18∶1/12∶0）含量顯著上升，反映出大鼠心肌缺血造模后的損傷；造模后大鼠血漿中1-磷酸鞘氨醇含量顯著降低，可能會(huì)導(dǎo)致血漿和免疫細(xì)胞滲漏到組織中，引發(fā)炎癥反應(yīng)；還可能引發(fā)血小板聚集，間質(zhì)間隙纖維蛋白沉積，間接造成血管損傷[39]。速效救心丸能夠顯著降低鞘氨醇、植物鞘氨醇和神經(jīng)酰胺（d18∶1/12∶0）這3個(gè)鞘脂類化合物含量，并能夠顯著提高1-磷酸鞘氨醇含量，提示速效救心丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)鞘脂代謝來(lái)發(fā)揮抗心肌缺血的作用。

綜上所述，本研究篩選得到了39個(gè)與心肌缺血及速效救心丸治療作用相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，富集到7條代謝通路。分析表明，速效救心丸發(fā)揮抗心肌缺血的作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)通路及鞘脂代謝通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究從代謝組學(xué)的角度為速效救心丸防治心肌缺血的作用機(jī)制研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)也可為速效救心丸的臨床合理應(yīng)用提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Suxiao Jiuxin Pills against myocardial ischemia based on metabolomics

JIA Zhi-xin1, 2, PAN Ming-xia3, LIU Li-rong3, ZHU Mei-xia3, FANG Cong3, YU Zhi-ying3, LIU Jie1, 2, LI Yue-ting2, 3, XIAO Hong-bin1, 2

1. Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Research Center for Chinese Medical Analysis and Transformation, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. School of Chinese Materia Medical, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To study the effect of Suxiao Jiuxin Pills (速效救心丸, SJP) on metabolites in plasma of rats with myocardial ischemia, and preliminarily explore the metabolic pathway and possible mechanism of its intervention on myocardial ischemia.Myocardial ischemia rats model was established by pituitrin and the protective effect of SJP on heart was determined by pathological tissue sections and creatine kinase (CK), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH), lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) biochemical tests. Metabolomics studies of plasma samples was conducted by UHPLC-QTOF/MS to screen potential biomarkers and enrich metabolic pathways.SJP significantly improved the pathological changes of heart in rats with myocardial ischemia; Significantly decreased the activities of CK, AST, HBDH and LDH in plasma (0.05, 0.01), and increased SOD activity (0.05, 0.01). A total of 39 potential biomarkers were screened, mainly involving 7 metabolic pathways including alanine, aspartic acid and glutamate metabolism, tricarboxylic acid cycle, glutamine and glutamate metabolism.SJP can effectively improve myocardial ischemia injury in model rats, and may play a role in related pathways such as energy metabolism and sphingolipid metabolism.

Suxiao Jiuxin Pills; myocardial ischemia; metabolomics; potential biomarkers; energy metabolism; sphingolipid metabolism; alanine, aspartic acid and glutamate metabolism; tricarboxylic acid cycle

R285.5

A

0253 - 2670(2022)15 - 4719 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.015

2022-04-13

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7214284）

賈志鑫，博士，助理研究員，研究方向?yàn)樗幬锓治?、代謝組學(xué)、中藥藥效物質(zhì)研究。Tel: (010)53911875 E-mail: jessiejzx@163.com

通信作者：肖紅斌，博士，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治?、中藥新藥研發(fā)。Tel: (010)53911883 E-mail: hbxiao69@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]