劉雪城，丁平剛，金皓潔，何凌云*，劉陶世*

反式西紅花酸-環(huán)糊精包合物的制備、表征、安全性和抗腫瘤評(píng)價(jià)

劉雪城1, 2，丁平剛1，金皓潔2，何凌云2*，劉陶世1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 南京艾德凱騰生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，江蘇 南京 211100

制備難溶性藥物反式西紅花酸（-crocetin，TC）與甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物（TC-MβCD），并評(píng)價(jià)包合物對(duì)TC溶解度、安全性和有效性的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法篩選環(huán)糊精種類等工藝參數(shù)，采用冷凍干燥法制備TC-MβCD。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、UV法、體外釋放度測定法等對(duì)TC-MβCD包合物進(jìn)行表征，采用HPLC法測定TC含量。采用Caco-2細(xì)胞模型研究TC與TC-MβCD的體外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。采用斑馬魚魚卵/胚胎發(fā)育保護(hù)模型評(píng)價(jià)TC-MβCD包合物的安全性，采用體外乳腺癌4T1細(xì)胞和裸鼠體內(nèi)乳腺癌MCF-7腫瘤模型對(duì)比研究TC及TC-MβCD的體內(nèi)外抗腫瘤活性。在5種環(huán)糊精中，MβCD對(duì)TC的增溶效果最好，優(yōu)化包合工藝參數(shù)為料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時(shí)間120 min。TC-MβCD凍干粉中TC含量2.2%，增溶效果顯著，復(fù)溶性良好。SEM和UV法表明TC被MβCD的空穴結(jié)構(gòu)包合，TC-MβCD凍干粉可在0.1%聚山梨酯80-pH 6.8介質(zhì)中釋放，其擬合曲線符合一級(jí)釋藥模型。Caco-2細(xì)胞模型表明TC轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，包合促進(jìn)吸收。斑馬魚魚卵/胚胎發(fā)育試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TC-MβCD包合物對(duì)斑馬魚的孵化率、斑馬魚胚胎的存活率和心率幾乎沒有影響，表明包合物安全性好。乳腺癌4T1細(xì)胞體外抗腫瘤表明TC-MβCD的IC50明顯低于TC，說明包合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制作用。裸鼠體內(nèi)MCF-7腫瘤模型表明，相同藥物劑量下，TC-MβCD的抑制率為33.71%，遠(yuǎn)高于TC的16.86%。采用相溶解度法篩選出合適的環(huán)糊精，通過冷凍干燥制備TC-MβCD凍干粉，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。TC被MβCD包合后，顯著增加了TC的溶解度，提高了TC的抗腫瘤活性和安全性，為TC包合物制劑工業(yè)化生產(chǎn)提出理論依據(jù)。

反式西紅花酸；甲基-β-環(huán)糊精；包合物；表征；藥物釋放；抗腫瘤

反式西紅花酸（-crocetin，TC）是西紅花與梔子等中的主要活性成分之一，具有抗癌、改善潰瘍結(jié)腸炎、神經(jīng)保護(hù)和保肝護(hù)臟等藥理活性[1-3]。但其幾乎不溶于水、乙醇、甲醇、醋酸乙酯，易溶于堿溶液，口服吸收差，易氧化不穩(wěn)定，極大地限制了其藥理效應(yīng)的發(fā)揮[4-7]。為提高TC的水溶性、穩(wěn)定性和藥效，國外先后將西紅花酸制成聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］納米粒、脂質(zhì)體、微囊和樹枝狀大分子等新型給藥系統(tǒng)，但效果不太理想[8-12]。環(huán)糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖以及其半合成衍生物的總稱。環(huán)糊精在食品和藥品行業(yè)有著廣泛應(yīng)用，在藥物制劑中環(huán)糊精常作為藥物載體用于提高藥物溶解度、提高藥物穩(wěn)定性、矯味、緩釋和靶向作用等[13-14]，常用的環(huán)糊精主要有α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精及其衍生物。不同環(huán)糊精因結(jié)構(gòu)差異使得其包合性能有所不同。采用環(huán)糊精包合技術(shù)擬提高TC的水溶性、穩(wěn)定性和藥效是值得探索的方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)TC環(huán)糊精包合物的制備工藝、質(zhì)量表征、體外釋藥、吸收機(jī)制、安全性和抗腫瘤藥理活性進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，為后續(xù)TC與甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物TC-MβCD的新藥研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD檢測器，日本島津儀器公司；XP型分析天平（＝0.01 mg）、S220-K pH計(jì)，梅特勒托利多公司；UV-2450PC型紫外/可見分光光度計(jì)，日本島津儀器公司；ZNCL- GS型磁力攪拌器，南京文爾儀器設(shè)備有限公司；LY0-0.5型真空冷凍干燥機(jī)，上海東富龍科技有限公司；FEI PHENO型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會(huì)社；Thermo HERA cell 150i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；Millicell-ERS型細(xì)胞電阻儀，美國Millipore公司；Transwell培養(yǎng)板，美國Corning公司；BCM-1000A型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Vision G2 Elite 8型智能溶出儀，美國Hanson公司；MD34透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量1000），美國Viskase公司；Nikon TS100型倒置顯微鏡，日本尼康公司；Zeiss Axio Vert. A1型熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss AG；MK3&4MK2酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司。

1.2 材料

TC對(duì)照品，批號(hào)wkq16041207，四川省維克奇生物科技有限公司，HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%；TC原料藥，批號(hào)190106，濟(jì)南浩化實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；甲醇，Honeywell公司，色譜純；α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、MβCD、羥丙基-β-環(huán)糊精，山東濱州智源生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞（American type culture collection，ATCC）、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；CCK-8試劑盒（Bioworld公司）；Caco-2細(xì)胞株（American type culture collection，ATCC）；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（R11053.9），廣州銳博生物技術(shù)有限公司；水為高純水，其他化學(xué)試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚，4月齡野生型AB斑馬魚，購買于南京一樹梨花公司。雄性裸鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（22±2）g，購買于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 TCHPLC測定方法學(xué)的建立

2.1.1 色譜條件[15]LC-20A島津高效液相色譜儀，色譜柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（75.0∶24.5∶0.5），檢測波長423 nm，柱溫35 ℃，體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 TC對(duì)照品(A)和TC-MβCD包合物(B) 的HPLC圖

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取TC-MβCD凍干粉10 mg，置20 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋，超聲破化包合結(jié)構(gòu)，使其充分溶解，冷卻至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 線性范圍考察 精密稱取5.01 mg TC對(duì)照品至100 mL量瓶中，加吡啶5.0 mL溶解，流動(dòng)相稀釋至刻度，即得50.1 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。即得含TC 0.100 2、0.501、1.002、4.008、8.013、12.024、16.032、20.04 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。以峰面積（）為響應(yīng)值對(duì)TC的質(zhì)量濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為＝12 704 1＋11 760，2＝0.999 8，表明TC在0.100 2～20.04 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取12.024 μg/mL對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，峰面積的RSD為0.39%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備包合物供試品溶液，取12.024 μg/mL TC對(duì)照品溶液和TC包合物供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)行測定，前者RSD為0.47%，后者RSD為1.44%，結(jié)果表明10 h內(nèi)對(duì)照品溶液和供試品溶液穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備包合物供試品溶液6份，包合物中TC的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.25%，RSD為0.77%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份TC-MβCD包合物，精密稱定，分別按樣品中TC含量添加TC對(duì)照品適量（80%、100%、120%各3份），測得TC平均加樣回收率為96.37%，RSD為2.15%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.1.8 樣品測定 取各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下樣品，制備成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件檢測各個(gè)樣品中TC含量。

2.2 相溶解度法研究環(huán)糊精對(duì)TC的增溶作用

2.2.1 環(huán)糊精種類、用量和溫度對(duì)TC的增溶試驗(yàn) 分別精密稱定α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、MβCD、羥丙基-β-環(huán)糊精，用蒸餾水分別配制成濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L的溶液。加入過量TC于上述溶液中，分別在15、37、60 ℃避光條件下置于電熱恒溫震蕩水槽（轉(zhuǎn)速為200 r/min）振搖48 h，溶解平衡后，微孔濾膜濾過（0.45 μm），測定濾液中TC的含量。表1結(jié)果表明，當(dāng)不添加環(huán)糊精時(shí)，TC在水中的溶解度很小，僅有0.72 μg/mL，當(dāng)添加環(huán)糊精后，TC在水中的溶解度增大，其增溶效果與環(huán)糊精種類、用量和溫度有關(guān)。環(huán)糊精濃度越大、溫度越高、增溶效果越好。但是只有MβCD對(duì)TC的增溶效果顯著，其他4種環(huán)糊精增溶效果不理想。

2.2.2 MβCD對(duì)TC的包合常數(shù)（） 包合物的形成過程是主客體相互選擇性識(shí)別的動(dòng)態(tài)平衡過程，而值大小能夠反映出環(huán)糊精和藥物形成包合物過程中結(jié)合力的強(qiáng)弱[5]。一般值越大說明包合效果越好。通過包合物的相溶解度曲線得出其線性方程，再計(jì)算。

＝/[0(1－)]

為相溶解度曲線的斜率，0為TC在各溫度下水中的飽和溶解度

表2結(jié)果表明，隨著溫度的升高，MβCD對(duì)TC的逐漸增大，說明升高溫度包合效果越好。MβCD在不同溫度下，與TC包合的吉布斯自由能變化（Δ）＜0，表明MβCD與TC的包合自發(fā)進(jìn)行，根據(jù)熱力學(xué)第2定律，疏水作用在包合中起主要作用。

表1 不同溫度條件下環(huán)糊精種類和用量對(duì)TC增溶效果的比較(, n = 3)

Table 1 Comparison of cyclodextrin types and amounts on solubilization of TC at different temperatures (, n = 3)

表1 不同溫度條件下環(huán)糊精種類和用量對(duì)TC增溶效果的比較(, n = 3)

溫度/℃環(huán)糊精種類溶解度/(μg?mL?1) 2 mmol?L?14 mmol?L?16 mmol?L?18 mmol?L?110 mmol?L?1 15α-環(huán)糊精0.73±0.521.19±0.271.13±0.861.37±0.751.42±0.68 β-環(huán)糊精0.65±0.290.83±0.500.89±0.571.05±0.541.27±0.80 γ-環(huán)糊精0.46±0.320.48±0.310.53±0.170.69±0.430.81±0.34 MβCD1.42±0.343.34±0.486.32±0.638.25±0.6510.55±0.85 羥丙基-β-環(huán)糊精0.79±0.401.15±0.391.73±0.482.48±0.542.53±0.65 37α-環(huán)糊精0.95±0.451.21±0.371.32±0.821.40±0.681.60±0.45 β-環(huán)糊精0.69±0.291.00±0.370.99±0.701.37±0.431.49±0.85 γ-環(huán)糊精0.38±0.110.55±0.260.51±0.150.97±0.150.87±0.26 MβCD1.52±0.293.30±0.496.29±0.609.09±0.6311.27±0.85 羥丙基-β-環(huán)糊精0.92±0.311.43±0.402.04±0.452.75±0.482.96±0.59 60α-環(huán)糊精1.48±0.681.94±0.482.25±0.762.70±0.712.89±0.37 β-環(huán)糊精1.14±0.231.68±0.292.31±0.602.61±0.432.80±0.80 γ-環(huán)糊精1.11±0.891.32±0.371.31±0.591.72±0.461.91±0.32 MβCD1.90±0.383.72±0.436.41±0.599.32±0.7112.44±0.87 羥丙基-β-環(huán)糊精1.14±0.881.91±0.372.29±0.463.16±0.603.62±0.51

表2 MβCD對(duì)TC的K值

2.3 TC-MβCD包合物的制備

將MβCD在一定溫度下配成一定濃度的溶液，稱取一定量的TC置于溶液中，在恒溫磁力攪拌器上攪拌（轉(zhuǎn)速1000 r/min）一定時(shí)間，冷凍干燥，即得TC-MβCD包合物。

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)考察環(huán)糊精用量和攪拌條件對(duì)TC-MβCD包合率的影響 以不同MβCD質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、10%、30%、50%、70%）、不同攪拌時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、不同攪拌溫度（40、50、60、70、80 ℃）以及不同攪拌速率（200、500、1000、1500 r/min）為考察因素，包合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各單因素對(duì)TC-MβCD包合率的影響，結(jié)果不同MβCD質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)TC-MβCD的包合率分別為0、（38.6±3.3）%、（78.4±3.8）%、（85.6±4.3）%、（86.2±3.7）%（＝3），不同攪拌時(shí)間時(shí)TC-MβCD的包合率分別為（32.6±4.2）%、（57.3±2.3）%、（78.6±3.4）%、（81.7±2.3）%、（74.3±3.6）% （＝3），不同攪拌溫度時(shí)TC-MβCD的包合率分別為（56.4±1.2）%、（78.6±2.0）%、（82.2±1.7）%、（82.6±1.9）%、（83.0±1.5）%（＝3），不同攪拌速率時(shí)TC-MβCD的包合率分別為（73.6±1.4）%、（76.9±1.9）%、（77.4±1.8）%、（78.6±2.0）%、（78.3±1.6）%（＝3）。結(jié)果表明，MβCD用量越大，溫度越高，包合率越高，但溫度大于60 ℃后包合率增加不明顯。包合率隨著攪拌時(shí)間延長相應(yīng)提高，但大于150 min后包合率反而下降。攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)包合率的影響不顯著。

2.3.2 采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝參數(shù) 選取影響包合效果較大的MβCD質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1）、攪拌溫度（2）和攪拌時(shí)間（3）3個(gè)因素，設(shè)置3個(gè)水平對(duì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)[16]。結(jié)果見表3。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上表數(shù)據(jù)進(jìn)行2次多項(xiàng)式回歸擬合，該實(shí)驗(yàn)的2項(xiàng)式擬合方程為包合率＝?133.125－0.1721＋4.9462＋1.3013＋0.011 812＋2.250×10?313－2.500×10?323－0.012 912－0.043 222－5.018×10?332，該方程表明影響包合率的因素主次順序?yàn)閿嚢铚囟龋緮嚢钑r(shí)間＞料液比。

表3 處方工藝的Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖2和表4結(jié)果表明，模型優(yōu)化后給出的最佳參數(shù)為料液比33.74%、攪拌溫度58.41 ℃、攪拌時(shí)間127.12 min、包合率為86.614%。結(jié)合大生產(chǎn)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行修正，得到TC-MβCD 包合工藝料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時(shí)間120 min。

采用以上包合工藝制備3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證，其包封率分別為86.4%、85.7%、87.0%，結(jié)果表明，該工藝重復(fù)性良好，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好。

2.4 TC-MβCD包合物的表征

利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測原料藥的吸收峰與包合的吸收峰之間的差異[13,18]。圖3表明，TC包合后其在400～500 nm的吸收峰消失。

加強(qiáng)PPP投資型項(xiàng)目安全管理，預(yù)防安全事故發(fā)生，這是提升項(xiàng)目建設(shè)效益的重要保障。但調(diào)查顯示，部分參與單位將工作重心放在如何提高項(xiàng)目質(zhì)量方面，對(duì)安全管理不重視，沒有根據(jù)項(xiàng)目安全管理需要，制定健全的安全管理制度。再加上在項(xiàng)目運(yùn)行中忽視加強(qiáng)安全管理，不注重預(yù)防安全事故，最終導(dǎo)致不必要損失發(fā)生，降低項(xiàng)目建設(shè)效益。

圖2 X1、X2、X3對(duì)包合率影響的3D曲面圖和等高線圖

表4 方差分析結(jié)果

圖3 TC (A)、TC和MβCD物理混合物(B) 與TC-MβCD包合物(C) 的紫外吸收光譜圖

利用SEM觀察TC原料藥及包合物的形態(tài)[17]，圖4結(jié)果表明TC呈微小顆粒結(jié)晶形狀，MβCD呈原弧片狀形片狀，而包合物不同于主客體的形貌，大小和形狀呈現(xiàn)了不規(guī)則的塊狀形貌，以上表明主客體之間形成了包合物，結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生改變。

2.5 TC-MβCD的體外釋放[19-20]

精密稱取一定量的TC原料藥和等藥量的TC- MβCD包合物，用0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液混懸后放入截留相對(duì)分子質(zhì)量1000的透析袋內(nèi)，兩端用透析夾夾緊保證不滲漏，分別置于以900 mL 0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液為介質(zhì)的溶出杯中，將其置于智能溶出儀中，設(shè)置溫度（37.0±0.1）℃，轉(zhuǎn)速75 r/min，進(jìn)行體外釋放，取樣點(diǎn)分別為10、15、30、45、60、90 min及2、3、4、6、8、10、12、18 h。每次取樣10 mL，同時(shí)補(bǔ)加相同溫度的等量介質(zhì)溶液。樣品溶液用0.45 μm針筒濾頭過濾后，進(jìn)樣測定TC的質(zhì)量濃度，計(jì)算累積釋放率。TC原料藥因?yàn)樵卺尫沤橘|(zhì)中溶解度太低，HPLC難以檢測，未繪制出釋藥曲線。TC-MβCD包合物的藥物釋放曲線結(jié)果見圖5。表5結(jié)果表明，TC從包合物中的釋放符合一級(jí)速率釋藥，具有緩釋效果。

圖4 TC (A)、MβCD (B)、TC-MβCD包合物(C)的SEM圖

圖5 TC-MβCD包合物在0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8介質(zhì)中藥物釋放曲線(, n = 3)

表5 TC-MβCD包合物在介質(zhì)中藥物釋放擬合方程

2.6 Caco-2細(xì)胞模型研究TC與TC-MβCD包合物的體外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[21-22]

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，取跨膜電阻大于600 Ω/cm2的Transwell培養(yǎng)板，首先，將細(xì)胞單層用預(yù)熱（37 ℃）的空白漢克平衡鹽溶液（HBSS）洗滌3次，在Apical側(cè)（AP）到Basolatera側(cè)（BL）的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)中，將等濃度的TC溶液與TC-MβCD包合物溶液加0.5 mL到AP面作為供給池，將1.5 mL HBSS（pH 7.4）添加到BL中作為接收池。在BL到AP轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)中，將等濃度的TC溶液或TC- MβCD包合物溶液分別加1.5 mL到BL中，并將0.5 mL HBSS添加到AP中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行孔。置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在120 min時(shí)吸取接收池溶液各200 μL進(jìn)行HPLC測定。結(jié)果見表6。TC的app（AP→BL）值與app（BL→AP）值與相差不大（＞0.05），說明TC跨越腸上皮細(xì)胞的可能主要轉(zhuǎn)運(yùn)途徑為被動(dòng)擴(kuò)散。但TC的app（AP→BL）值與app（BL→AP）值與TC-MβCD包合物有顯著性差異 （＜0.05），說明包合促進(jìn)了TC的吸收，從TC和TC-MβCD包合物的app（BL→AP）/app（AP→BL）值均小于1.5可以看出TC可能不存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。TC并非通過胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)及載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，而是主要通過被動(dòng)的跨細(xì)胞擴(kuò)散而滲透[2]。

表6 制劑對(duì)TC (20 μmol?L?1) 在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

2.7 TC-MβCD包合物對(duì)斑馬魚魚卵/胚胎發(fā)育的安全性

選取健康的5 hpf的魚卵均勻的分到24孔板中，每孔20枚魚卵。將用E3溶液配制好的含TC不同質(zhì)量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）的TC-MβCD包合物溶液分別加入到相應(yīng)的孔中，每孔加入3 mL溶液，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。每孔的魚卵作為1個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。分別于24、48、72、96 hpf觀察胚胎的發(fā)育情況，并統(tǒng)計(jì)24、48、72、96 hpf的胚胎累積死亡率、畸形率、孵化率以及72、96 hpf的心率、體長等。心率的檢測方式：在Leica DMi8顯微鏡4倍視野下計(jì)算斑馬魚幼蟲心臟1 min完成搏動(dòng)的次數(shù)。體長的計(jì)算方法：在Leica DMi8顯微鏡4倍視野下測量斑馬魚幼蟲眼睛中心到尾巴末端的直線距離。結(jié)果見圖6和表7，結(jié)果表明TC-MβCD包合物中TC不同質(zhì)量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率均在90.0%及以上。將所得存活率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度下TC-MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的存活率均無顯著性差異。

圖6 在24、48、72、96 hpf時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚的代表性光學(xué)圖像(, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率(, n = 3)

Table 7 Survival rate of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率(, n = 3)

孵育時(shí)間/hpf存活率/% 對(duì)照10 μg?mL?150 μg?mL?1100 μg?mL?1150 μg?mL?1200 μg?mL?1 2495.66±4.3595.50±5.0895.69±4.1098.07±3.6295.82±4.3594.37±5.31 4896.62±3.8795.98±4.1295.82±3.6298.55±3.8796.30±3.8793.89±4.83 7295.50±3.6494.69±4.5895.98±3.8697.75±5.3195.82±5.0793.73±4.38 9695.98±4.3495.66±4.3596.46±3.4898.55±5.0795.50±4.1293.73±4.83

由表8可知，TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的累積孵化率最低值均出現(xiàn)在200 μg/mL的質(zhì)量濃度下，其72、96 hpf的孵化率平均孵化率為86.70%和85.08%。將所得孵化率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度下TC-MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的孵化率無顯著性差異。

表9結(jié)果表明，將所得心率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度下TC- MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的心率無顯著性差異。

表8 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的孵化率(, n = 3)

Table 8 Hatchability of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表8 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的孵化率(, n = 3)

孵育時(shí)間/hpf孵化率/% 對(duì)照10 μg?mL?150 μg?mL?1100 μg?mL?1150 μg?mL?1200 μg?mL?1 7293.98±2.1292.75±1.6393.08±1.6896.30±3.5096.14±4.4586.70±1.87 9694.14±2.0992.59±2.5892.59±1.3994.91±4.4295.99±3.4785.08±0.53

表9 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的心率(, n = 3)

Table 9 Heart rate of zebra fish eggs/larvae continuously incubated at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表9 TC-MβCD包合物不同質(zhì)量濃度持續(xù)孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的心率(, n = 3)

組別質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)心率/(次?min?1) 對(duì)照?166.54±17.89 TC-MβCD包合物10176.70±14.13 50175.96±9.36 100181.91±14.54 150173.23±11.90 200174.72±23.83

2.8 CCK8法測定TC與TC-MβCD包合物的體外抗腫瘤活性

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4T1細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的4T1細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞），用0.25%胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)。將4T1細(xì)胞接種到96孔板中，每孔7000個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定加入的TC原料藥的濃度為0、50、100、200、300、400、500 μmol/L和TC-MβCD包合物制劑濃度為（以TC計(jì)）0、25、50、100、200、300、400 μmol/L，以未處理的細(xì)胞為對(duì)照。第2天，根據(jù)藥物濃度的不同將細(xì)胞分成12組，更換含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每種濃度6個(gè)重復(fù)進(jìn)行測試。處理48 h后進(jìn)行CCK8檢測，即各組細(xì)胞在檢測時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加10 μL CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。選擇450 nm波長，在酶標(biāo)儀法上測定各孔吸光度（）值，記錄結(jié)果。利用GraphPad Prism軟件的Dose-response- inhibition算法計(jì)算得出藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（IC50），結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，TC原料藥隨著濃度增大其乳腺癌細(xì)胞存活率下降，且呈明顯的濃度依賴性。在低濃度時(shí)（≤200 μmol/L）包合物與原料藥相比細(xì)胞存活率相差不大。在高濃度時(shí)（≥200 μmol/L）細(xì)胞存活率包合物均小于原料藥。經(jīng)GraphPad Prism軟件計(jì)算，原料藥對(duì)4T1細(xì)胞的IC50＝356.0 μmol/L，包合物制劑對(duì)4T1細(xì)胞的 IC50＝283.5 μmol/L，說明TC包合物比TC原料藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制作用。

圖7 TC與TC-MβCD包合物不同濃度下的細(xì)胞毒性試驗(yàn)(, n = 6)

2.9 裸鼠體內(nèi)MCF-7腫瘤模型研究TC與TC- MβCD包合物的體內(nèi)抗腫瘤活性

2.9.1 動(dòng)物分組與模型的建立 實(shí)驗(yàn)前將雄性裸鼠（22±2）g保持在無病原體的條件下，正常進(jìn)食飲水1周后，將對(duì)數(shù)生長期的0.1 mL MCF-7細(xì)胞懸液（1×107細(xì)胞/mL）接種到雄性裸鼠的右腋皮下，建立腫瘤模型。當(dāng)平均腫瘤模型體積達(dá)到60 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3組（＝6）：對(duì)照組、TC組、TC-MβCD組。

2.9.2 給藥與治療 對(duì)照組、TC組和TC-MβCD包合物組分別以0.9%鹽溶液，游離的TC（含50 mg/kg TC的0.5%羥丙基甲基纖維素溶液）和TC-MβCD包合物（相當(dāng)于50 mg/kg的TC）劑量ig從第1天到第12天，每天1次。腫瘤體積用游標(biāo)卡尺測量，并在第1、3、5、7、9、11、13天測量小鼠的腫瘤體積。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死并剝離腫瘤，統(tǒng)計(jì)分析腫瘤體積，計(jì)算腫瘤體積抑制率。然后對(duì)腫瘤進(jìn)行蘇木精和曙紅（HE）染色以評(píng)估病理變化。

2.9.3 結(jié)果 圖8結(jié)果表明，TC和TC-MβCD包合物均對(duì)腫瘤表現(xiàn)出治療作用，并在給藥后，伴隨著腫瘤壞死。與TC治療相比，TC-MβCD包合物治療后腫瘤的HE染色顯示細(xì)胞間間隙增大，組織壞死增加。治療2周的體積-時(shí)間曲線如圖9所示。與對(duì)照組相比，兩者相同劑量的TC和TC-MβCD包合物，TC-MβCD包合物的抑制率為33.71%，遠(yuǎn)高于TC（16.86%），TC-MβCD包合物增強(qiáng)了TC的抗腫瘤作用（＜0.05）。

圖8 HE染色觀測抗腫瘤活性

與TC組比較：*P＜0.05

3 討論

本研究比較了α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、MβCD、羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)TC的增溶效果，發(fā)現(xiàn)只有MβCD對(duì)TC的增溶效果顯著，其他4種環(huán)糊精增溶效果一般。環(huán)糊精包合方法有飽和水溶液法、超聲法、研磨法、冷凍干燥法、噴霧干燥法等，考慮到TC-MβCD的易溶于水和熱穩(wěn)定性，選擇冷凍干燥法制備TC-MβCD；單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MβCD用量越大，包合溫度越高，包合時(shí)間越長，TC的包合率越高，但溫度大于60 ℃后包合率增加不明顯，包合時(shí)間大于150 min后包合率反而下降，此外發(fā)現(xiàn)攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)包合率的影響不顯著；采用Box- Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選出最佳包合條件為料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時(shí)間120 min。

本實(shí)驗(yàn)采用SEM和紫外光譜驗(yàn)證了TC-MβCD包合物的形成，采用Caco-2細(xì)胞模型研究了TC與TC-MβCD的體外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)包合物能促進(jìn)TC的吸收。體外釋放度研究表明，TC包合物顯著提高了TC的溶解度并具有一定的緩釋作用，釋藥模型呈一級(jí)釋放模型。環(huán)糊精包合物中藥物在消化道的釋藥除了與包合物中藥物的擴(kuò)散滲漏有關(guān)外，還受消化酶和大腸菌群對(duì)環(huán)糊精的降解和消化道其它成分的置換等因素影響，但目前的釋放介質(zhì)難以復(fù)制這些因素，后續(xù)將進(jìn)一步開展TC-MβCD的結(jié)構(gòu)和藥動(dòng)學(xué)系統(tǒng)性研究以闡明環(huán)糊精包合對(duì)TC生物利用度的影響。

裸鼠體內(nèi)MCF-7腫瘤模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與TC原料藥相比，TC包合物的體內(nèi)抗腫瘤藥理活性明顯增強(qiáng)，這可能是由于環(huán)糊精包合物的增溶和緩釋作用，提高了TC的生物利用度所致。由于CCK-8檢測非常方便快捷，且CCK-8對(duì)細(xì)胞的毒性很小，檢測靈敏度高且重復(fù)性好，故體外抗腫瘤選用CCK8檢測。體外乳腺癌4T1細(xì)胞模型試驗(yàn)表明TC包合物比TC原料藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制作用。采用斑馬魚魚卵/胚胎發(fā)育試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TC-MβCD包合物對(duì)斑馬魚的孵化率、斑馬魚胚胎的存活和心率幾乎沒有影響，表明包合物安全性好。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, characterization, safety and antitumor evaluation of-crocetin cyclodextrin inclusion complex

LIU Xue-cheng1, 2, DING Ping-gang1, JIN Hao-jie2, HE Ling-yun2, LIU Tao-shi1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nanjing CoreTech Biomedical Co., Ltd., Nanjing 211100, China

To prepare insoluble drugs-crocetin (TC) and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) inclusion complex (TC-MβCD), and evaluate the effect of inclusion complex on the solubility, safety and effectiveness of TC.The kinds of cyclodextrins and other process parameters were selected by single factor test and Box-Behnken response surface method, and TC-MβCD was prepared by freeze-drying method. The inclusion complex of TC-MβCD was characterized by scanning electron microscope, UV method andrelease assay, and the content of TC was determined by HPLC. Caco-2 cell model was used to study the transport mechanism of TC and TC-MβCD. The safety of TC-MβCD inclusion complex was evaluated by using zebrafish egg/embryo development protection model. The anti-tumor activity of TC and TC-MβCDandwas compared by using 4T1 breast cancer cell anti-tumor modeland MCF-7 tumor model in nude mice.Among the five cyclodextrins, MβCD had the best solubilization effect on TC. The optimized inclusion process parameters were as follows: solid-liquid ratio 33%, stirring temperature 60 ℃, stirring time 120 min. The content of TC in TC-MβCD lyophilized powder was 2.2%, which had remarkable solubilization effect and good resolubility. Scanning electron microscopy and UV method showed that TC was encapsulated by the hole structure of MβCD, and TC-MβCD lyophilized powder could be released in the range of 0.1% Tween80-pH 6.8, The fitting curve accorded with the first-order drug release model. Caco-2 cell model showed that the transport mechanism of TC was passive diffusion, and inclusion promoted absorption. Zebrafish egg/embryo development test found that TC-MβCD inclusion complex had little effect on zebrafish hatching rate, zebrafish embryo survival rate and heart rate, indicating that the inclusion complex was safe. The anti-tumor activity of 4T1 cellsshowed that the IC50of TC-MβCD was significantly lower than that of TC, indicating that the inclusion compound had a stronger inhibitory effect on breast cancer cells. The MCF-7 tumor model in nude mice showed that under the same drug dose, the inhibition rate of TC MβCD was 33.71%, much higher than 16.86% of TC.Appropriate cyclodextrins were screened out by phase solubility method, and TC-MβCD lyophilized powder was prepared by freeze-drying and evaluated. The inclusion of TC by MβCD significantly increases the solubility of TC, improves the antitumor activity and safety of TC, and provides a theoretical basis for the industrial production of TC inclusion complex preparations.

-crocetin; methyl-β-cyclodextrin; inclusion complex; characterization; drug release; antitumor

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4663 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.009

2022-01-19

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81403114）

劉雪城，碩士研究生，從事中藥制藥技術(shù)與開發(fā)研究。Tel: 15738510895 E-mail: liuxuecheng0924@126.com

通信作者：何凌云，博士，碩士生導(dǎo)師，從事中藥制藥技術(shù)與開發(fā)研究。Tel: 13057657678 E-mail: helina@core-tech.com.cn

劉陶世，博士，碩士生導(dǎo)師，副研究員，從事中藥藥劑學(xué)研究。Tel: 13611504994 E-mail: tsliur4111@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]