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        加熱模式對添加葡萄糖氧化酶鰱魚糜凝膠特性的影響

        2022-08-02 03:10:40程夢穎張海萍劉友明熊善柏
        食品科學 2022年14期
        關(guān)鍵詞:水浴加魚糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

        程夢穎,張海萍,劉友明*,熊善柏

        (華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢),湖北 武漢 430070)

        魚糜制品因具有高蛋白、低膽固醇以及富含不飽和脂肪酸等特點,深受廣大消費者的喜愛。對于熱誘導(dǎo)魚糜凝膠而言,熱加工是制備魚糜制品過程中的重要工序,加熱模式的不同對魚糜凝膠形成能力有重要影響。目前,傳統(tǒng)的加熱模式是二段式水浴加熱,其中凝膠化溫度和熟化方式對魚糜蛋白的變性和凝膠形成能力有重要影響。在凝膠化階段,主要利用內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(glutamine transaminase,TG)的作用使肌球蛋白最大的亞基聚合或共價結(jié)合,形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而不同的凝膠化溫度和時間對魚糜凝膠特性有不同影響。在熟化階段,熟化方式的不同可能會導(dǎo)致魚糜組織蛋白酶活性有所區(qū)別,目前家用較多的熟化方式有水浴、蒸制和微波加熱。有學者發(fā)現(xiàn)加熱方式的不同對魚糜凝膠特性有一定影響。

        隨著消費者習慣和觀念的變化,預(yù)制調(diào)理食品受到越來越多的關(guān)注。開發(fā)新型獨具特色且適合家庭烹飪的魚糜調(diào)理制品,可豐富魚糜制品的種類,為消費者提供更多選擇。淡水魚糜具有凝膠形成能力差的缺點。研究表明,加入適量葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)會提高魚糜的凝膠特性。同時,實驗室前期實驗表明,適當?shù)难趸瘯龠M鰱魚糜凝膠的交聯(lián)。本研究以GOD促氧化交聯(lián)的鰱魚糜為原料,研究不同加熱模式對鰱魚糜凝膠品質(zhì)的影響,并通過低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)分析鰱魚糜凝膠水分狀態(tài)的變化,結(jié)合掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu),確定適宜的加熱模式,以期為制備高品質(zhì)的鰱魚糜調(diào)理制品提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        冷凍鰱魚糜(AAA級) 洪湖市井力水產(chǎn)食品股份有限公司。

        GOD(10U/g) 上海源葉生物科技有限公司;NaCl、尿素(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        AUY220分析天平 日本島津公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;K600(3250)食物調(diào)理機 德國博朗電器公司;722型分光光度計 上海舜宇恒平精密科學儀器有限公司;FJ-200高速分散均質(zhì)機上海標本模型廠;Ultrascan XE型色度儀 美國Hunter Lab公司;TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司;AVANTI J-26高速冷凍離心機 美國Backman公司;NMI20 LF-NMR成像儀 上海紐邁電子科技有限公司;JSM-6390 LV掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

        1.3 方法

        1.3.1 不同加熱模式魚糜凝膠的制備

        參考方海硯等的方法制作魚糜凝膠。將冷凍魚糜于4 ℃解凍,將解凍后魚糜調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分數(shù)至78%,用食品調(diào)理機預(yù)斬拌2 min后,加入質(zhì)量分數(shù)2% NaCl和0.5‰ GOD,斬拌4 min后用真空包裝機排氣,再灌入腸衣(直徑25 mm),采用兩段式加熱模式進行加熱。加熱模式設(shè)置:第1段凝膠化溫度分別設(shè)置為4、25、40 ℃;第2段熟化方式分別設(shè)置水浴加熱、沸水蒸制、微波加熱。微波加熱時需將魚腸腸衣除去。不同加熱模式具體參數(shù)見表1。制成魚糜凝膠后于流水下冷卻30 min(微波加熱制成的凝膠放入塑封袋進行冷卻),置于4 ℃冰箱貯藏過夜。

        表1 不同加熱模式參數(shù)Table 1 Parameters of different heating modes

        1.3.2 魚糜凝膠強度測定

        參考米紅波等的方法,將樣品從冰箱中取出,在室溫下平衡30 min,切成高度20 mm的圓柱體,用質(zhì)構(gòu)分析儀測定樣品凝膠強度。測定參數(shù):探頭P/0.25S,壓縮距離15 mm,測前速率5 mm/s,測試速率l mm/s,測后速率5 mm/s,穿刺曲線上的第1個峰值即破斷力,每個樣品至少做5 個平行。凝膠強度為破斷力與凹陷深度之積。

        1.3.3 三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-溶解肽含量的測定

        參考付湘晉等的方法,稱取1 g樣品與9 mL提前預(yù)冷的5% TCA溶液混合,6 000 r/min均質(zhì)1 min,放入4 ℃冰箱中靜置1 h,12 000 r/min離心15 min,采用Lowry法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量,TCA-溶解肽含量以每克樣品所含酪氨酸物質(zhì)的量表示(μmol/g)。每組樣品至少測定3 個平行。

        1.3.4 白度測定

        參考Petcharat等的方法,將魚糜凝膠切成厚度約5 mm的圓片,采用色度儀測定樣品亮度值(*)、紅度值(*)和黃度值(*),測定前用標準白板對色差儀校正。按式(1)計算白度():

        1.3.5 持水性測定

        參考馬海建等的方法,將樣品切成厚度約5 mm的薄片,準確稱質(zhì)量,記為/g,用2 層濾紙包裹放入10 mL離心管中,4 000 r/min離心10 min,離心結(jié)束后取出樣品再次稱質(zhì)量,記作/g。按式(2)計算持水性:

        1.3.6 LF-NMR弛豫時間的測定

        參考李睿智等的方法,將樣品在室溫下恒溫30 min,切成高度20 mm的圓柱并轉(zhuǎn)入核磁管中,采用CPMG脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間、峰面積比測定。參數(shù)設(shè)定:質(zhì)子振動頻率22 MHz、90°脈寬14 μs,采樣帶寬100 kHz,90°與180°脈沖間隔時間200 μs,重復(fù)掃描次數(shù)8,重復(fù)采樣等待時間4 500 ms。檢測結(jié)束所得CPMG指數(shù)衰減曲線采用Multi xp InvAnalysis軟件進行反演,得到峰面積比例。

        1.3.7 魚糜凝膠LF-NMR成像方法

        參考楊文鴿等的方法,采用LF-NMR成像軟件及MSE序列采集魚糜凝膠的橫向圖像,測試條件:掃描3 層,層厚3.0 mm,層間距3.0 mm;穩(wěn)定時間1 000 ms,回波時間9.42 ms;重復(fù)掃描次數(shù)16,K空間像素大小192h256。利用成像軟件(上海紐邁電子科技有限公司)對質(zhì)子密度圖不同灰度值區(qū)域賦予不同顏色,得到魚糜凝膠水分子質(zhì)子密度偽彩圖。

        1.3.8 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

        參考吳曉麗等的方法并略作修改,將制備的樣品切成2 mmh2 mmh1 mm的薄塊,用2.5%戊二醛固定2~7 h后,用乙醇溶液進行梯度洗脫15 min,再用醋酸異戊酯洗脫20 min。將處理好的樣品經(jīng)臨界點干燥,噴金處理后,然后用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu),電子束加速電壓為3 kV。

        1.3.9 掃描電鏡圖片處理

        按照Dàvila等的方法對掃描電鏡圖片進行閾值化和二值化處理,然后采用圖像分析軟件ImageJ 1.42q及其插件FracLac-2.5 Release 1 d分析掃描電鏡圖片。分形維數(shù)和平均孔隙當量直徑參考朱玉安等的方法計算??紫懂斄恐睆娇梢灾庇^反映魚糜凝膠的孔隙大?。环中尉S數(shù)反映魚糜凝膠體系的空間復(fù)雜程度,分形維數(shù)越大說明體系越復(fù)雜,分形維數(shù)越小,說明體系的均勻性越好。

        1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析

        參考Wasson等的方法,略作修改。取18 mL 95 ℃ 5 g/100 mL SDS溶液加入2 g切碎的魚糜凝膠中,均質(zhì)后于85 ℃水浴1 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液,調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取200 μL 2 mg/mL蛋白溶液加入40 μL含(或不含)5%-巰基乙醇蛋白上樣緩沖液,混合均勻后沸水浴加熱3 min,進樣體積為10 μL。用5%濃縮膠、10%分離膠。使用0.125 g/100 mL考馬斯亮藍R-250溶液染色,使用脫色液(體積分數(shù)50%甲醇-10%醋酸-40%蒸餾水)脫色。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        每組實驗樣品做3 次平行。使用SPSS 23和Origin 2018軟件進行差異顯著性分析,顯著性水平為0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 加熱模式對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

        由圖1可知,在凝膠化階段,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下魚糜凝膠的破斷力和凝膠強度最高,而低溫長時(4 ℃、8 h)魚糜的破斷力最低,中溫中時(25 ℃、3 h)魚糜的凹陷深度和凝膠強度最低??赡艿脑蚴?,中溫中時和低溫長時模式下,魚糜蛋白凝膠交聯(lián)不完善,蛋白分子不能完全伸展,形成松散、穩(wěn)定性差的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),魚糜凝膠化不充分,從而降低了魚糜凝膠強度。值得注意的是,在低溫長時模式下,魚糜凝膠的凹陷深度較大,可能是因為低溫誘導(dǎo)形成的凝膠三維結(jié)構(gòu)延展性更好。

        圖1 加熱模式對魚糜凝膠強度的影響Fig.1 Effect of heating mode on gel strength of surimi gel

        在熟化階段,與傳統(tǒng)水浴加熱相比,沸水蒸制魚糜凝膠的凹陷深度和凝膠強度均無顯著變化(>0.05),而在微波加熱條件下魚糜凝膠的破斷力和凝膠強度顯著增大(<0.05),此時魚糜凝膠破斷力和凝膠強度分別達到530.25 g和586.94 ggcm,相比水浴加熱分別提高了43.17%和53.75%。這可能是因為微波加熱能使魚糜蛋白的交聯(lián)度更高,形成更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而提高了魚糜凝膠強度。

        2.2 加熱模式對魚糜凝膠TCA-溶解肽的影響

        TCA可溶性肽主要來源于魚糜中蛋白質(zhì)的降解,其含量的變化可準確反映蛋白質(zhì)的酶解情況。如圖2所示,在凝膠化階段,低溫長時(4 ℃、8 h)模式下魚糜凝膠TCA-溶解肽含量最低,而高溫短時(40 ℃、1 h)魚糜的TCA-溶解肽含量最高,可能是因為隨著凝膠化溫度的升高,魚糜內(nèi)源性蛋白酶活性增加,在酶解作用下肌原纖維蛋白等大分子被降解成小分子肽,從而使TCA-溶解肽的含量升高。

        圖2 加熱模式對魚糜凝膠TCA-溶解肽的影響Fig.2 Effect of heating mode on TCA-soluble peptide content of surimi gel

        在熟化階段,微波加熱條件下魚糜凝膠的TCA-溶解肽含量顯著低于其他兩種加熱方式(<0.05),而沸水蒸制與水浴加熱的TCA-溶解肽含量無顯著差異(>0.05)。這可能是因為TCA-溶解肽主要由組織蛋白酶分解蛋白產(chǎn)生低分子質(zhì)量肽形成,而微波加熱使魚糜在加熱過程中快速通過劣化帶,從而抑制了魚糜蛋白被組織蛋白酶降解,因此TCA-溶解肽含量較低。

        2.3 加熱模式對魚糜凝膠色度的影響

        由表2可知,在凝膠化階段,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下形成的魚糜凝膠的最大,達到79.81,魚糜凝膠*、*也達到最大值,而*較低。有研究表明魚糜凝膠的變化與魚糜蛋白變性程度密切相關(guān),可能是由于肌紅蛋白的變性和持水性的改變,在凝膠化溫度為40 ℃時凝膠蛋白的變性程度對保持魚糜白度較為適宜。

        表2 加熱模式對魚糜凝膠色度的影響Table 2 Effect of heating mode on color parameters of surimi gel

        在熟化階段,改變熟化方式對魚糜凝膠影響顯著(<0.05)。微波加熱魚糜的*和顯著高于水浴加熱和沸水蒸制(<0.05),可能是因為微波加熱使魚糜凝膠快速通過凝膠劣化溫度段,蛋白質(zhì)變性減弱,導(dǎo)致高于其他熟化方式,有研究表明,微波加熱會改善魚糜凝膠的。

        2.4 加熱模式對魚糜凝膠持水性的影響

        由圖3可知,在凝膠化階段,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下魚糜凝膠的持水性最高,達到71.92%,低溫長時(4 ℃、8 h)模式下魚糜凝膠的持水性最低。這可能是因為在凝膠化溫度為4 ℃和25 ℃時,形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對水分的束縛較弱,導(dǎo)致魚糜凝膠的持水性降低;在凝膠化溫度為40 ℃時,凝膠蛋白之間產(chǎn)生疏水相互作用,使凝膠結(jié)構(gòu)更加有序,從而增加凝膠化過程中保留水分的能力,提高持水性。

        圖3 加熱模式對魚糜凝膠持水性的影響Fig.3 Effect of heating mode on water-holding capacity of surimi gel

        在熟化階段,沸水蒸制魚糜凝膠持水性與水浴加熱魚糜無顯著差異(>0.05),而微波加熱條件下魚糜凝膠的持水性較水浴加熱魚糜顯著提高(<0.05)。可能是因為微波加熱對蛋白質(zhì)交聯(lián)促進作用較強,使更多水分被束縛,從而提高魚糜凝膠的持水性。有報道也發(fā)現(xiàn)微波加熱制成的魚糜凝膠持水性高于傳統(tǒng)水浴加熱魚糜,有助于形成高品質(zhì)魚糜凝膠。

        2.5 加熱模式對魚糜凝膠水分狀態(tài)的影響

        2.5.1 加熱模式對魚糜凝膠弛豫特性的影響

        如表3所示,魚糜凝膠水分子可分為3 種狀態(tài):表示結(jié)合水,表示不易流動水和表示自由水。在凝膠化階段,中溫中時(25 ℃、3 h)和高溫短時(40 ℃、1 h)模式下魚糜凝膠峰面積比例較高;低溫長時(4 ℃、8 h)模式下魚糜凝膠峰面積比例最低,為85.87%。這可能是因為,在凝膠化溫度為25 ℃和40 ℃時有利于魚糜蛋白交聯(lián),可以截留自由水轉(zhuǎn)化為不易流動水,使魚糜凝膠中不易流動水含量相對增加。

        表3 加熱模式對魚糜凝膠水分子T2峰面積比例的影響Table 3 Effect of heating mode on T2 peak area percentage of water in surimi gel

        在熟化階段,對比水浴加熱,沸水蒸制魚糜凝膠峰面積比例增加,但無顯著差異(>0.05),而微波加熱條件下魚糜凝膠峰面積比例顯著增加(<0.05),這可能是因為微波加熱條件下魚糜形成致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),束縛更多自由水,使其轉(zhuǎn)換為不易流動水。Mao Weijie等報道表明,微波加熱魚糜制品的不易流動水含量較水浴加熱魚糜更高。

        2.5.2 不同加熱模式下魚糜凝膠水分子質(zhì)子密度偽彩圖

        魚糜凝膠偽彩圖中,綠色區(qū)域?qū)?yīng)凝膠基質(zhì)中的不易流動水,橙色和紅色則表示局部高水平的自由水,通過顏色變化說明水分子在凝膠中分布狀態(tài)。如圖4所示,在凝膠化階段,低溫長時(4 ℃、8 h)和中溫中時(25 ℃、3 h)模式下魚糜凝膠偽彩圖中橙色和紅色較多,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下橙色和紅色較少,表明此模式下魚糜凝膠中自由水含量降低,而不易流動水含量增加。

        圖4 不同加熱模式下魚糜凝膠水分子質(zhì)子密度偽彩圖Fig.4 Pesudo-color map of water proton density of surimi gels under different heating modes

        在熟化階段,對比水浴加熱,沸水蒸制和微波加熱魚糜凝膠圖像中綠色明顯增多,且橙色和黃色逐漸消失,說明水分子在魚糜凝膠中的分布更均勻有序,這可能是因為微波加熱使魚糜凝膠形成更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),截留水分使不易流動水含量提高。

        2.6 加熱模式對魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

        由圖5可知,不同加熱模式下魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)明顯不同。在凝膠化階段,低溫長時(4 ℃、8 h)和中溫中時(25 ℃、3 h)模式下形成的魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)粗糙,而高溫短時(40 ℃、1 h)模式下魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較致密。

        圖5 不同加熱模式魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)(×10 000)Fig.5 Microstructure of surimi gels under different heating modes (× 10 000)

        由表4可知,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔隙當量直徑和分形維數(shù)最小,說明此時魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加均勻致密,這可能是因為此條件下蛋白結(jié)構(gòu)充分展開、相互交聯(lián),促進魚糜凝膠形成更致密有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究表明魚糜凝膠結(jié)構(gòu)越致密均勻,持水性越好,這與前述持水性結(jié)果一致(圖3)。

        表4 不同加熱模式魚糜凝膠的孔隙當量直徑和分形維數(shù)Table 4 Equivalent pore size and fractal dimension of surimi gels under different heating modes

        在熟化階段,傳統(tǒng)水浴加熱魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔洞較大,表面粗糙松散,而微波加熱條件下魚糜凝膠呈現(xiàn)清晰的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),表面平整,質(zhì)地致密,且此條件下魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的孔隙當量直徑與分形維數(shù)均最小,且與水浴加熱相比顯著降低(<0.05)。這可能是因為微波加熱能夠有效促進蛋白質(zhì)聚集交聯(lián),使魚糜凝膠形成較為均勻致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),增強了凝膠強度。

        2.7 加熱模式對魚糜蛋白交聯(lián)的影響

        如圖6所示,在凝膠化階段,低溫長時(4 ℃、8 h)和中溫中時(25 ℃、3 h)魚糜凝膠的肌球蛋白重鏈(myosin heavy china,MHC)條帶沒有明顯變化,在高溫短時(40 ℃、1 h)模式下MHC條帶明顯變淺,可能是因為此時內(nèi)源性蛋白酶活性增強,導(dǎo)致肌球蛋白降解。從還原型SDS-PAGE圖可以看出,分子質(zhì)量超過250 kDa的條帶變淺,說明此時魚糜蛋白存在二硫鍵交聯(lián),而低溫長時(4 ℃、8 h)和中溫中時(25 ℃、3 h)模式下在進樣口處蛋白聚集較多,說明此時蛋白交聯(lián)主要為非二硫鍵作用。同時,在高溫短時(40 ℃、1 h)模式下,肌球蛋白輕鏈條帶有明顯減弱的現(xiàn)象。

        圖6 加熱模式對魚糜凝膠SDS-PAGE的影響Fig.6 Effect of heating mode on SDS-PAGE pattern of surimi gel

        在熟化階段,水浴加熱較微波加熱處理后的MHC條帶顏色淺,這可能是因為傳統(tǒng)水浴加熱在凝膠劣化區(qū)滯留時間長,魚糜中的組織蛋白酶具有熱穩(wěn)定性,引起MHC降解,而微波加熱速率快可以快速通過凝膠劣化區(qū)并抑制內(nèi)源蛋白酶的活性,使肌球蛋白不易被水解。通過還原型SDS-PAGE可以看出,在加入-巰基乙醇后,分子質(zhì)量超過250 kDa的條帶明顯減弱,說明熟化階段二硫鍵在促進蛋白質(zhì)交聯(lián)中起主要作用,而在進樣口處也有少量聚集體,說明熟化過程中也有非二硫鍵的作用。

        3 結(jié) 論

        在凝膠化階段,高溫短時(40 ℃、1 h)模式下形成的魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性最好,形成了均勻緊密凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);在熟化階段,微波加熱條件下形成的魚糜凝膠強度、和持水性均達到最大值,魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)表面光滑且均勻致密。綜合考慮,40 ℃水浴加熱1 h+微波加熱3 min的加熱模式顯著改善了添加GOD的鰱魚糜凝膠性能,為開發(fā)新型魚糜調(diào)理制品提供了理論基礎(chǔ)。

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