王 冠，李小妮，楊萬邦，薛麗芳，張興平，李建設，鄧 云

（1.寧夏大學農學院 銀川 750021； 2.北京大學現(xiàn)代農業(yè)研究院 山東 濰坊 261000；3.寧夏農林科學院園藝研究所 銀川 750002）

西瓜（L.）是一種重要的經濟作物，在全世界廣泛種植，中國是世界上最大的西瓜生產與消費國?？菸∈俏鞴系闹饕『χ?，給西瓜生產造成嚴重損失。尖孢鐮孢菌西瓜專化型（f. sp.，F(xiàn)ON）是西瓜枯萎病的主要致病菌，存在明顯的種內分化，根據(jù)其對不同抗病品種的致病力，劃分為4 個生理小種，分別是生理小種0、1、2 和3。

寧夏回族自治區(qū)是我國著名的壓砂西瓜和夏季西瓜產區(qū)，由于長期的連作，該地區(qū)西瓜枯萎病發(fā)病日益嚴重，然而寧夏地區(qū)西瓜枯萎病致病病原菌鑒定未見研究報道。迄今為止，國內報道了4 個生理小種中的3 個，分別為小種0、1 和2，生理小種3 尚未見報道。其中生理小種0 在河北、武漢和安徽被報道。生理小種1 在中國是優(yōu)勢小種，已在河北、湖北、新疆、黑龍江、山東和北京被報道。而生理小種2 僅在河北被報道。Zhou 等首次報道了在美國馬里蘭州引起PI 296341-FR 枯萎病發(fā)病率高于78%的病原菌，并將其鑒定為新的生理小種，即生理小種3。

2021 年筆者在寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村金城5 號商品西瓜生產基地觀察到典型的枯萎病病株，該品種高抗枯萎病生理小種1。為了明確該病害的病原種類，筆者采集典型發(fā)病植株進行病原菌分離純化，采用形態(tài)學和分子生物學方法進行病原菌鑒定，并利用西瓜鑒別寄主接種進行生理小種鑒定，為進一步防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病樣：2021 年7 月從寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村商品西瓜生產基地采集具有典型發(fā)病癥狀的西瓜植株。西瓜品種為金城5 號（由中衛(wèi)市金城種業(yè)有限責任公司選育），高抗枯萎病生理小種1。鑒別寄主：Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR，由國家西甜瓜種質資源中期庫友情提供。對照菌株：尖孢鐮孢菌西瓜?；蜕硇》N2（NXWFW011），與供試病樣分離自同一地塊，經鑒別寄主鑒定為生理小種2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 將采集到的發(fā)病植株沿莖基部剪下，用清水清洗干凈后，將樣品置于75%酒精中浸泡30 s，然后用無菌水沖洗3 次，滅菌濾紙吸干表面水分后，從病健交界處切取30 mm的小塊組織，接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上26 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，選擇形態(tài)與鐮孢菌相似的菌落，將分離菌株單孢純化后轉入PDA 培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性鑒定 2021 年10—11 月在山東省濰坊市北京大學現(xiàn)代農業(yè)研究院作物育種平臺采用柯赫氏法則對分離菌株進行致病性驗證。采用浸根法接種，將處于子葉展平期的Black Diamond 西瓜苗根系漂洗干凈后，在6×10個孢子·mL的孢子懸浮液中浸根30 s，隨后采用隨機區(qū)組方法栽種于32 孔穴盤中，基質經滅菌處理，在人工氣候室中培養(yǎng)，溫度26°C/22°C（日/夜），光照14 h/10 h（日/夜），相對濕度60%，以清水接種的幼苗作為對照，每個處理接種6 株，3 次重復。接種后的28 d內，持續(xù)觀察幼苗發(fā)病情況以確認分離菌株的致病性。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定 將純化好的病原菌接種至PDA 平板上，26 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)；在100 倍倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產生方式并拍照。然后依據(jù)相關分類方法進行種類鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定 采用CTAB 法提取 病 原 菌 基 因 組DNA，PCR 擴 增-區(qū) 序列。反應體系：DNA 模板1 μL、10 μmol·L上下游引物各2 μL、2×Plus PCR MasterMix（北京瑞博興科生物技術有限公司）25 μL，加ddHO 至50 μL。擴增條件：94 ℃預變性90 s，92 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司測序。將得到的序列在NCBI 中進行BLAST 比對，初步明確病原菌種類。

1.2.5 病原菌生理小種鑒定 2021 年11 月中旬至12 月底利用4 個西瓜鑒別寄主Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR 在北京大學現(xiàn)代農業(yè)研究院人工氣候室中鑒定病原菌的生理小種。將分離菌株的孢子懸浮液濃度調整至6×10個孢子·mL，用同樣的方法接種西瓜鑒別寄主，采用隨機區(qū)組方法以清水和生理小種2 菌株接種作為對照，每個處理接種12 株，3 次重復，用滅菌基質栽種于32 孔穴盤內。接種后培養(yǎng)條件同上，在接種后的28 d 內持續(xù)觀察發(fā)病情況。根據(jù)分離菌株對鑒別寄主的致病反應，鑒定其生理小種。

1.2.6 病情分級標準及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 統(tǒng)計時將西瓜枯萎病劃分為7 個等級，0 級：無感染癥狀；1 級：子葉邊緣黃化，生長正常；3 級：子葉枯萎，生長發(fā)育變緩；5 級：植株失水，表現(xiàn)出枯萎癥狀；7 級：整株枯萎死亡，根據(jù)發(fā)病級數(shù)，對鑒別寄主的單株進行表型判斷，0～3 級為抗病，5～7 級為感病。植株發(fā)病率=（感病株數(shù)/調查總株數(shù)）×100%，使用Excel 2019 統(tǒng)計感病植株數(shù)量并計算發(fā)病率，利用SPSS 26 對發(fā)病率進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

由圖1 可以看出，在發(fā)病地塊，西瓜感病植株呈簇狀或“熱點”分布，植株枯萎死亡。感病植株根系變成深褐色，根系逐漸壞死，無新生根系，維管束變褐。

圖1 西瓜枯萎病田間癥狀

2.2 病原菌形態(tài)特征

由圖2 可以看出，經分離純化后，獲得1 個純化菌株（NXWFW008）。菌株NXWFW008 在PDA培養(yǎng)基上形成圓形菌落，氣生菌絲生長旺盛纏繞成束，菌落邊緣整齊，氣生菌絲呈絲絨狀，白色至淡粉色，培養(yǎng)基背面淡粉色；小型分生孢子數(shù)量多，橢圓形，卵形或腎形，0～1 隔，以無隔為主，大小為（5.0～10.0）μm×（1.0～3.0）μm；大型分生孢子鐮刀型，數(shù)量較少，孢子細而彎曲，兩端均勻變尖，足胞明顯，多為3～5 隔，大小為（20.0～36.0）μm×（3.0～5.0）μm；產孢細胞在氣生菌絲上側生的分生孢子梗上形成，有稀疏分枝，單瓶梗，安瓿瓶形，較短，為典型的尖孢鐮孢菌特征。

圖2 病原菌鏡檢

2.3 分離菌株的致病性

由圖3 可以看出，接種菌株NXWFW008 導致西瓜感病品種Black Diamond 呈典型的枯萎病癥狀，接種7 d 后植株表現(xiàn)葉片輕度失水萎蔫，隨后癥狀進一步發(fā)展，西瓜整株萎蔫，根及莖基部壞死致整株死亡（圖3-b），與田間癥狀相同（圖1-b）。接種清水對照植株沒有任何枯萎癥狀（圖3-a）。且從發(fā)病植株中重新分離出了接種菌株，菌落形態(tài)與NXWFW008 一致，表明分離菌株NXWFW008 是西瓜枯萎病的致病菌。

圖3 致病性檢測

2.4 EF-1α基因序列分析

菌株NXWFW008 的-基因序列比對分析結果表明，NXWFW008 與Genbank 序列登記號為 MZ773247.1、MZ773246.1、MW505885.1 和MW315889.1 的參考菌株序列同源性均達99.7%，且依據(jù)最大似然法（ML）構建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，菌株NXWFW008 與上述參考菌株聚為一支，自舉支持率為100%，遺傳關系近（圖4）。因此，鑒定分離菌株NXWFW008 為f.sp.。

圖4 基于EF-1α 序列構建的ML 進化樹

2.5 病原菌生理小種鑒定

由表1 可以看出，4 個鑒別寄主對不同生理小種的抗感反應，Black Diamond 感所有生理小種，Crimson Sweet 抗生理小種0，Calhoun Gray 抗生理小種0 和1，PI 296341-FR 抗生理小種0、1 和2。

接種菌株NXWFW008 后，PI 296341-FR 發(fā)病率高達93.75%，而Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray 完全感病，發(fā)病率均為100%，不同鑒別寄主發(fā)病率無顯著差異（表1，圖5），4 個西瓜鑒別寄主均表現(xiàn)為高感病與生理小種3 抗感反應一致。接種菌株NXWFW011 后，Black Diamond、Crimson Sweet 和Calhoun Gray100%發(fā)病死亡，而PI 296341-FR 發(fā)病率為16.65%，表現(xiàn)為高抗。與NXWFW011（race 2）相比，菌株NXWFW008 能夠侵染PI 296341-FR 且發(fā)病率高達93.75%，因此鑒定NXWFW008 為生理小種3。

圖5 不同菌株和對照接種后4 個西瓜鑒別寄主發(fā)病情況

表1 鑒別寄主對不同生理小種的抗性及寄主對菌株NXWFW008 的鑒定結果

3 討論與結論

菌株NXWFW008 的形態(tài)學、分子生物學和鑒別寄主鑒定結果表明，分離自寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村的西瓜枯萎病致病菌為尖孢鐮孢菌西瓜?；蜕硇》N3（f.sp.，race 3）。張興平利用不同抗性的西瓜品種，對國內8 個省市的西瓜枯萎病菌分離物進行鑒定，首次證明了我國存在西瓜枯萎病生理小種分化，此后國內陸續(xù)報道了生理小種0、1 和2，優(yōu)勢致病菌為生理小種1。生理小種3 在全球分布較少，目前僅在美國馬里蘭州、佛羅里達州和喬治亞州被報道，本研究為尖孢鐮孢菌生理小種3 侵染導致的西瓜枯萎病在中國的首次研究報道。

生理小種3 在寧夏地區(qū)的出現(xiàn)，可能是由長期種植抗生理小種1 的品種對病原菌形成的高選擇壓力造成的。金山村商品西瓜生產基地已經連續(xù)種植超過25 年，瓜農均選擇種植抗生理小種1的栽培品種，包括金城5 號、冠龍、瑞龍等，主栽品種為金城5 號，有研究顯示金城5 號對枯萎病生理小種2 也有較強的抗性，長期種植抗病品種會對病原菌造成額外的選擇壓力，使病原菌向致病力更強的方向進化，生理小種2（NXWFW011）和生理小種3（NXWFW008）在同一地塊中被發(fā)現(xiàn)，為生理小種3 由生理小種2 進化而來提供了額外的證據(jù)。

生理小種3 的存在對寧夏地區(qū)的西瓜生產構成了新的威脅，增加了西瓜枯萎病防治的難度，目前還未見抗生理小種3 西瓜種質的報道，長期輪作和化學熏蒸被認為是防治由生理小種3 引起的西瓜枯萎病的最佳選擇。寧夏其他地區(qū)以及全國西瓜主產區(qū)枯萎病優(yōu)勢致病菌是否發(fā)生演變，急需開展全面的鑒定，以制定相應的防控措施來保障西瓜產業(yè)健康發(fā)展。