趙 華， 鄭 喆， 張 曼， 王藝會， 張 敏， 楊貞耐

(北京工商大學(xué) 食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048)

在歐美等發(fā)達(dá)國家，羊奶干酪由于其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值受到越來越多的關(guān)注，目前約70%的羊奶被用于制作干酪[1]。以羊奶為原料加工制得的干酪組織結(jié)構(gòu)細(xì)膩，風(fēng)味獨(dú)特，在很多方面優(yōu)于牛奶干酪[2]。干酪在成熟過程中會發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，原料乳成分[3]、凝乳劑[4]、發(fā)酵劑[5]和非發(fā)酵劑細(xì)菌[6]等因素對干酪特有香氣、風(fēng)味和質(zhì)地的形成具有重要影響。干酪成熟期間風(fēng)味和質(zhì)地的變化主要與蛋白質(zhì)、脂肪降解及糖酵解有關(guān)[7]。微生物凝乳酶因其具有相對較高的蛋白質(zhì)水解活性，對干酪的成熟和風(fēng)味形成具有一定的促進(jìn)作用[8]。因此，選用合適的微生物凝乳酶對于提升羊奶干酪的品質(zhì)具有重要的應(yīng)用價值。

解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1為芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，其發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶具有較高的凝乳活性和一定程度的蛋白質(zhì)水解活性[9]。本研究團(tuán)隊(duì)前期已成功地將解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶應(yīng)用于牛奶干酪加工中[10-11]，但對干酪，特別是羊奶干酪成熟期間理化特性變化的研究仍有所欠缺。本研究將GSBa- 1凝乳酶用于加工羊奶干酪，旨在評估此微生物凝乳酶產(chǎn)生的生化作用對羊奶干酪成熟的促進(jìn)作用。通過與商業(yè)凝乳酶制備的羊奶干酪進(jìn)行比較，探究以GSBa- 1凝乳酶制得的干酪在60 d成熟過程中干酪成分、乳酸乳球菌活菌數(shù)、干酪質(zhì)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步掌握新型微生物凝乳酶在干酪中的應(yīng)用技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶：北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提取制備，并于-80 ℃冷凍保藏。

氯化鈉、氯化鈣(食品級)，國藥集團(tuán)有限公司；鮮羊奶(脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.1%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.06%，乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.33%)，北京三胖牧場；乳酸乳球菌發(fā)酵劑XZ3303、QH27- 1，北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院乳品實(shí)驗(yàn)室，菌株源自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)；商業(yè)凝乳酶，丹麥科漢森有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL203型電子天平、FE20型數(shù)顯pH計，上海梅特利- 托利多儀器有限公司；HWS12型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；干酪槽，北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院乳品實(shí)驗(yàn)室自制；CT3型質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司；7090A- 7000型氣相色譜- 質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC- MS)聯(lián)用分析儀，美國Aglient公司；Kjeltec8100型凱氏定氮儀，美國FOSS公司；T25型Ultra- Turrax勻漿器，德國IKA公司；Tissuelyser- 48高通量組織破碎儀，上海凈信公司；XH- T漩渦混合器，江蘇新寶儀器有限公司；Q exactive高分辨質(zhì)譜儀[配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站]，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1羊奶硬質(zhì)干酪的制備

參照趙笑等[11]的方法，采用不同品種凝乳酶(A組：商業(yè)凝乳酶；B組：GSBa- 1凝乳酶)和同批次羊奶進(jìn)行羊奶硬質(zhì)干酪的制備，每組3個平行樣品。制作過程：將發(fā)酵劑X23303、QH27- 1按3%接種量活化3代后，以體積分?jǐn)?shù)1.5%接種量添加至經(jīng)過巴氏殺菌(65 ℃，30 min)的鮮羊奶中, 攪拌5 min,32 ℃發(fā)酵30 min，至pH值為6.5左右，然后加入CaCl2(0.005 g/mL)和凝乳酶(1 500 SU/mL)，攪拌5 min，32 ℃保溫靜置45 min至凝固。將凝塊切成2 cm3的立方體，32 ℃靜置15 min后，升溫至35 ℃，直至pH值降至6.1左右，此時完全排出乳清。將凝塊切碎攪拌至pH值為5.4左右，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.7%NaCl，攪拌均勻，裝入磨具，以30 g/cm3的壓力壓模過夜，壓好的干酪進(jìn)行真空包裝。干酪在4 ℃成熟60 d，分別取干酪成熟過程中1、7、14、21、42、60 d的樣品測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2培養(yǎng)基的配置

M17培養(yǎng)基(用于乳酸乳球菌，g/L)：大豆蛋白胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨2.5、酵母浸粉2.5、牛肉浸粉5.0、乳糖5.0、抗壞血酸鈉0.5、β-甘油硫酸鈉19.0、硫酸鎂0.25。pH值7.2±0.2，25 ℃。

1.3.3干酪得率及主要組分含量測定

在干酪制作過程中，準(zhǔn)確稱取并記錄NaCl、發(fā)酵劑、原料乳和干酪成品的質(zhì)量，干酪得率計算見式(1)。

(1)

依據(jù)GB 5009.003—2016《食品中水分的測定》測定干酪中的水分含量；依據(jù)GB 5009.005—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定干酪中的蛋白質(zhì)含量；根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》的方法測定干酪中的脂肪含量。

1.3.4干酪游離氨基酸含量測定

參照文獻(xiàn)[12]測定。樣品前處理：精確稱取50 mg樣品于離心管中，加入適當(dāng)體積0.1 mol/L鹽酸提取液，渦旋混勻并振蕩，12 000 r/min離心10 min，取上清液備用。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品經(jīng)柱前衍生化，取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣品上清液過0.22 μm濾膜，采用超高效液相色譜- 高分辨率質(zhì)譜法進(jìn)行檢測。根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出干酪中各游離氨基酸的含量。色譜條件：ACCQ- TAG TMULTRA C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)液相色譜柱,流速0.5 mL/min,柱溫65 ℃,進(jìn)樣量1 μL,流動相A為AccQ·TagtmUltra Eluent A，流動相B為AccQ·TagtmUltra Eluent B，梯度洗脫。質(zhì)譜條件：正離子靈敏度模式檢測，噴霧電壓3 kV，輔助氣溫度320 ℃，輔助氣流量10 L/min，鞘氣溫度 350 ℃，鞘氣流量40 L/min。

1.3.5干酪質(zhì)構(gòu)分析

將干酪樣品切成1 cm3的立方體在室溫下放置0.5 h后進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。質(zhì)構(gòu)分析儀參數(shù)設(shè)定為：測試前速度2.0 mm/s，測試中速度0.5 mm/s，返回速度0.5 mm/s，循環(huán)2次，數(shù)據(jù)點(diǎn)頻率50點(diǎn)/s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載0.007 N，探頭型號為TA 3/100。每個樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.6干酪微生物指標(biāo)測定

在干酪成熟1、7、14、21、42、60 d時，采用騰軍偉等[9]的方法測定干酪中的活菌數(shù)。準(zhǔn)確稱取5 g干酪，加入54 mL、40 ℃溫浴的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%檸檬酸鈉溶液，充分勻漿2 min。處理好的樣品加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水逐級稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，涂布于M17固體平板，培養(yǎng)3 d后對乳酸乳球菌進(jìn)行計數(shù)。

1.3.7干酪風(fēng)味物質(zhì)的測定

參照騰軍偉等[10]的方法，準(zhǔn)確稱取6 g干酪樣品，切碎后放置于30 mL萃取瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)品后加蓋用封口膜密封，置于60 ℃水浴鍋中平衡30 min。固相微萃取吸附30 min(60 ℃)，插入氣相色譜的進(jìn)樣口，240 ℃解析5 min，進(jìn)行GC- MS分析鑒定。

GC條件：升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持3 min，溶劑延遲3 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃后，以10 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持1 min。載氣He，恒定流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度240 ℃，采用不分流模式。

MS條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)測定至少重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 18.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊奶干酪得率及成熟過程干酪組分變化分析

2.1.1干酪得率分析

羊奶干酪得率見表1。由表1可知，以商業(yè)凝乳酶制備的干酪 A 與以解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶制備的干酪 B比較，二者干酪得率相差不大，干酪B略低于干酪A，這可能是由于GSBa- 1凝乳酶水解蛋白質(zhì)，造成乳清析出。

表1 羊奶干酪得率

2.1.2干酪成熟過程中主要組分含量變化分析

不同凝乳酶制得的干酪的組成成分會有所差異[13]，羊奶干酪成熟過程中不同組分含量的變化見圖1。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

干酪水分含量是影響干酪品質(zhì)的重要因素。由圖1(a)可知，成熟期間(1 d后)，干酪B的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于干酪A；兩組干酪在成熟期間水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與祝敏[14]的結(jié)果相似。這是由于干酪B中的殘?zhí)桥c賴氨酸反應(yīng)生成水分而成熟后期，干酪游離水的蒸發(fā)造成質(zhì)量損失[15-16]。

羊奶干酪成熟期間脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化見圖1(b)。干酪B在成熟前14 d，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升，最高值達(dá)到31.77%，這與lvarez等[17]對山羊奶干酪的研究結(jié)果一致；而干酪A在成熟第7天時脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值28.96%。在成熟后期，兩組干酪脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)降低趨勢，這可能是因?yàn)槌墒旌笃?，在微生物和酶的作用下，干酪?nèi)部的脂肪被降解為脂肪酸等物質(zhì)[18]。

殘留于干酪基質(zhì)的凝乳酶對干酪成熟過程中游離氨基酸的形成具有一定的影響，同時干酪中的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)反映了干酪蛋白質(zhì)的降解程度。羊奶干酪在成熟期間蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和總游離氨基酸質(zhì)量比變化見圖1(c)和圖1(d)。在成熟過程中，干酪B的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于干酪A。干酪B在成熟第14天，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，為45.95%；而干酪A在成熟第7天時，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為37.26%。兩組干酪在成熟后期蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢降低，總游離氨基酸質(zhì)量比逐漸增加，這可能是隨著成熟時間的增加，干酪內(nèi)部蛋白質(zhì)被凝乳酶或發(fā)酵劑降解為小分子肽，并進(jìn)一步降解為游離氨基酸[19]。尤其在成熟14 d后，干酪B中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降，總游離氨基酸質(zhì)量比明顯增加，可能是GSBa- 1凝乳酶水解和乳酸菌釋放的各種酶共同作用的結(jié)果。在成熟前期，干酪的游離氨基酸質(zhì)量比降低，推測造成該現(xiàn)象的原因?yàn)橛坞x氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用降解生成風(fēng)味物質(zhì)[20]。在成熟后期，干酪A游離氨基酸的質(zhì)量比高于干酪B，這可能與兩組干酪中蛋白酶的活性不同有關(guān)；隨著干酪成熟時間的延長，乳酸菌可能發(fā)生自溶而釋放肽酶，進(jìn)而促進(jìn)游離氨基酸的產(chǎn)生[21]。

由干酪基質(zhì)中凝乳酶降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的小分子肽可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成風(fēng)味前體物質(zhì)，促進(jìn)干酪良好風(fēng)味的形成，對干酪的最終味道產(chǎn)生顯著影響[4]。干酪成熟期間各游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化見表2。表2顯示隨著成熟時間延長，游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P<0.05)。芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、支鏈氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸)和含硫氨基酸(半胱氨酸、蛋氨酸)是風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，對干酪風(fēng)味形成產(chǎn)生重要影響。干酪A中存在少量的半胱氨酸，而干酪B中質(zhì)量分?jǐn)?shù)更低，且在7 d和21 d時未檢出。兩組干酪中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的氨基酸皆為亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸，且干酪B中苯丙氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和絲氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高。

表2 羊奶干酪成熟期間游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.2 干酪成熟過程中活菌數(shù)變化分析

羊奶干酪成熟期間乳酸乳球菌活菌數(shù)變化見圖2。兩組干酪的活菌數(shù)在成熟過程中均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢。在干酪成熟前21 d活菌數(shù)明顯上升，這可能是由于成熟早期干酪中乳酸菌可利用乳糖生長繁殖[22]。隨著干酪中殘留的乳糖被完全分解，乳酸菌因無營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充而降低或喪失活力。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.3 干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)變化分析

干酪的質(zhì)構(gòu)是影響干酪品質(zhì)特性的重要參數(shù)之一，羊奶干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)的變化見圖3。圖3顯示隨著成熟時間的增加，兩組干酪的質(zhì)構(gòu)變化趨勢大體相似。在干酪成熟第14天，彈性、咀嚼性達(dá)到最低值，主要是因?yàn)椴糠枝罶1酪蛋白被凝乳酶水解成肽而導(dǎo)致酪蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)變?nèi)?，干酪結(jié)構(gòu)變得松散[23]；而硬度達(dá)到最高值，可能是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生新的離子基團(tuán)與干酪中的游離水形成結(jié)合和解結(jié)合的平衡態(tài)，導(dǎo)致干酪成熟過程游離水含量及硬度的變化[24]。在干酪成熟第21天，黏度達(dá)到最高值，這可能與干酪成熟過程中pH值變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的疏水作用變化有關(guān)[17]。隨著成熟時間延長，內(nèi)聚性不斷降低，這與干酪中蛋白質(zhì)的降解有關(guān)，部分酪蛋白被降解為小分子的氨基酸和肽段，使得干酪的內(nèi)聚性降低[21]。在成熟前期，干酪B質(zhì)構(gòu)特性較佳。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.4 干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化分析

干酪的風(fēng)味是干酪基質(zhì)中存在的多種揮發(fā)性化合物相互作用的結(jié)果，如醇類、酯類、酸類、酮類。本研究采用GC- MS結(jié)合NIST Library數(shù)據(jù)庫比對，對羊奶干酪中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。表3顯示了2種羊奶干酪在1、7、14、21、42、60 d時揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量比的變化。羊奶干酪一般風(fēng)味物質(zhì)的形成主要是通過發(fā)酵劑中乳球菌發(fā)生自溶現(xiàn)象而產(chǎn)生的胞內(nèi)酶和胞外酶以及GSBa- 1凝乳酶對乳蛋白的水解作用，其中GSBa- 1凝乳酶的水解產(chǎn)物可能會進(jìn)一步促進(jìn)干酪風(fēng)味前體物質(zhì)的生成[25-27]。

續(xù)表3

續(xù)表3

醇類化合物作為干酪重要的風(fēng)味化合物，主要通過乳糖、檸檬酸鹽、甲基酮、氨基酸代謝等生化反應(yīng)生成[26]。兩組干酪中均檢出3-甲基丁醇、2,3-丁二醇和己醇，干酪B中還檢出辛醇。3-甲基丁醇由亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶生物合成及Strucker降解生成，賦予干酪麥芽味和堅果味[25]；2,3-丁二醇的形成主要通過檸檬酸代謝途徑將乙偶姻還原，賦予干酪水果香氣[27]。

酸類化合物是影響干酪風(fēng)味的主要成分之一，由碳水化合物分解代謝、脂類降解和蛋白質(zhì)水解形成，也是甲基酮、仲醇、酯類等風(fēng)味物質(zhì)的前體化合物[26]。兩組干酪中均有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、正癸酸、苯甲酸檢出，干酪B還生成了壬酸。其中，己酸和辛酸閾值較低，在高濃度下使干酪產(chǎn)生令人不悅的風(fēng)味。苯甲酸由苯丙氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶生物合成及Strucker降解生成，賦予干酪堅果味[25]。

酮類化合物也是干酪風(fēng)味物質(zhì)的重要組分，主要來源于脂肪酸的β-氧化和檸檬酸鹽代謝[26]。兩組干酪均檢出3-羥基-2-丁酮和2-壬酮，干酪B還生成了2-庚酮。3-羥基-2-丁酮主要通過檸檬酸鹽代謝途徑將雙乙酰還原生成[27]，賦予干酪奶油味，且隨著成熟時間的延長，3-羥基-2-丁酮質(zhì)量比不斷增加。由于乳酸菌的代謝[28]，2-壬酮賦予干酪花香味、水果味和桃子味；2-庚酮由亞油酸氧化后生成，賦予干酪奶油香味。在成熟過程中，2-壬酮質(zhì)量比呈不同程度的增加。在成熟期較長的干酪中，2-庚酮帶有的霉味和油漆味，對干酪風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。

此外，酯類對干酪風(fēng)味形成有重要影響，主要通過醇(主要為乙醇)和酸的酯化反應(yīng)生成。兩組干酪中均檢出碳酸甲乙酯，在不同成熟時間，碳酸甲乙酯質(zhì)量比差異顯著(P<0.05)。兩組干酪均檢出二甲基砜，其主要由乳蛋白中甲硫氨酸、天冬氨酸降解生成，使干酪?guī)в心逃臀逗鸵游禰25]。

圖4為干酪A、B的主成分分析結(jié)果。圖4(a)顯示了干酪A中，PC1的貢獻(xiàn)率為60.9%，PC2的貢獻(xiàn)率為17.5%；圖4(b)顯示了干酪B中，PC1的貢獻(xiàn)率為63.2%，PC2的貢獻(xiàn)率為18.9%。不同樣品之間距離都相對較遠(yuǎn)，比較分散，表明樣品之間的揮發(fā)性成分存在一定的差異，可以很好地解釋不同成熟度干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化[29]。干酪A中42 d和60 d樣品距離較近，干酪B中21 d、42 d和60 d樣品距離較近，表明干酪A和干酪B分別在42、21 d基本成熟，可能是由于解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶和乳酸菌代謝對干酪的促熟作用，因此GSBa- 1凝乳酶可縮短干酪成熟時間，進(jìn)而降低制造成本。對不同成熟期羊奶干酪風(fēng)味化合物的 OAV (香氣活度值)進(jìn)行主成分分析，從而對干酪的差異進(jìn)行表征，并進(jìn)一步得到對奶酪差異貢獻(xiàn)度較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[29]。在成熟期60 d時，己醇、乙酸、2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮是兩組干酪共同的風(fēng)味物質(zhì)，此外干酪A產(chǎn)生了丁酸，干酪B產(chǎn)生了2-壬酮、苯甲酸。

圖4 不同成熟時期羊奶干酪的主成分分析

3 結(jié) 論

本研究分析了解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶對羊奶干酪成熟特性的影響。解淀粉芽孢桿菌GSBa- 1凝乳酶對羊奶干酪的得率、理化指標(biāo)、組分無不良影響，提升了干酪持水力和成熟前期的彈性、咀嚼性和內(nèi)聚性，促進(jìn)了苯丙氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和風(fēng)味物質(zhì)的生成，縮短了羊奶干酪的成熟期，對羊奶干酪的品質(zhì)提升起到了促進(jìn)作用。研究旨在為微生物凝乳酶在羊奶干酪中的應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)，希望有助于提升我國食品行業(yè)對羊奶干酪的研究和開發(fā)，為消費(fèi)者提供新穎的乳制品。