邢麗紅, 孫偉紅, 朱盼盼, 孫曉杰, 李兆新

扇貝組織中不同形態(tài)氨基脲測(cè)定方法研究

邢麗紅1, 2, 3, 孫偉紅1, 2, 3, 朱盼盼1, 2, 3, 孫曉杰1, 2, 3, 李兆新1, 2, 3

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266033; 3. 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 遼寧 大連 116034)

為明確環(huán)境新型污染物--氨基脲(semicarbazide, SEM)在貝類體內(nèi)的存在形態(tài), 本文建立了一種SEM在扇貝中形態(tài)測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析方法。扇貝中SEM總量測(cè)定方法為: 樣品用鹽酸水解, 以2-硝基苯甲醛為衍生劑衍生, 乙酸乙酯提取, 超濾離心凈化, 進(jìn)LC-MS/MS分析。結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定方法為: 樣品分別采用50%甲醇水溶液、75%甲醇水溶液、甲醇和水洗滌后, 按照SEM總量測(cè)定方法處理, 采用甲醇和2 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫, 電噴霧離子源正離子(electrosprary ionization, ESI+)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)SEM進(jìn)行定性和定量測(cè)定。本方法在1～20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)大于0.999。SEM在1.00、5.00、10.0 μg/kg添加水平的回收率在84.2%～118%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%。本方法扇貝中SEM的定量限為1.0 μg/kg, 本方法靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便, 適用于扇貝中SEM存在形態(tài)的測(cè)定。

氨基脲; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法; 扇貝; 存在形態(tài)

氨基脲(semicarbazide, SEM)是呋喃西林藥物在動(dòng)物體內(nèi)的特征代謝產(chǎn)物, 由于呋喃西林原型藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝快速, 因此通常以檢測(cè)SEM來(lái)判定是否非法使用呋喃西林[1-3]。歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和中國(guó)先后制定了禁止使用該類藥物的規(guī)定[4-6]。歐盟2003/181/EC規(guī)定硝基呋喃類代謝物在各種檢測(cè)方法中的靈敏度為1 μg/kg[7]。中國(guó)在水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中以1 μg/kg作為硝基呋喃類代謝物的判定限量。但近年來(lái)研究表明, 呋喃西林的代謝降解并非是水產(chǎn)品中SEM殘留的唯一來(lái)源, 很多途徑均可以引入SEM污染[8]。偶氮二甲酰胺作為一種塑料發(fā)泡劑, 常用在與食品接觸的材料中, 其在高溫下可分解產(chǎn)生SEM[9-10]; 偶氮二甲酰胺作為面粉發(fā)泡劑, 在高溫條件下可分解產(chǎn)生SEM[11-13]; 食品經(jīng)次氯酸鹽處理可產(chǎn)生SEM[14]; SEM天然存在于一些動(dòng)物和植物體內(nèi)[2, 15-16]。各種途徑產(chǎn)生的SEM均可能排入環(huán)境, 成為環(huán)境中的一種污染物, 污染水生生物賴以生存的環(huán)境, 最終在其體內(nèi)蓄積。目前有文獻(xiàn)報(bào)道部分海域的海水、海底沉積物已經(jīng)受到不同程度的污染, 同時(shí)在海洋生物體內(nèi)檢測(cè)到SEM殘留[17-20]。貝類通過(guò)富集海水中的SEM, 從而影響該類產(chǎn)品的質(zhì)量安全, 并通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。

呋喃西林進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后能夠快速代謝, 其代謝產(chǎn)物SEM主要以結(jié)合態(tài)形式在生物體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[21-23], 結(jié)合態(tài)SEM通過(guò)常用的食品烹飪方法如蒸煮、煎炸、烘烤和微波加熱等方式均無(wú)法使其完全降解[24], 而游離態(tài)SEM則可通過(guò)洗滌等方式去除[25-26]。貝類產(chǎn)品對(duì)SEM具有一定的富集能力, 然而環(huán)境中的SEM進(jìn)入貝類體內(nèi)究竟是以何種形態(tài)存在尚不明確。SEM常用的測(cè)定方法有高效液相色譜法[27-28]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[29-30]、酶聯(lián)免疫分析[31-32]、膠體金免疫分析法[33]等。現(xiàn)有檢測(cè)方法尚無(wú)針對(duì)貝類產(chǎn)品中SEM形態(tài)的測(cè)定方法。本文通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法, 建立了貝類組織中SEM存在形態(tài)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法, 本研究為分析環(huán)境污染物SEM在貝類產(chǎn)品中的存在形態(tài)奠定良好的基礎(chǔ), 同時(shí)也為評(píng)估貝類產(chǎn)品中氨基脲含量提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

AB 5500 Qtrap LC-MS/MS儀(配島津LC20 HPLC儀, 美國(guó)AB SCIEX公司); 分析天平(感量0.01 g, 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)); Vortex 2渦旋混合器(德國(guó)IKA公司); IS-RDS3恒溫振蕩器(美國(guó)精騏有限公司); Himac GR22G高速離心機(jī)(日本日立公司); N-EVAP 112氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)Organomation 公司); 微量高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.2 材料與試劑

SEM?HCl標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%, Dr.Ehrenstorfer GmbH公司); SEM-13C,15N2(純度99.2%, WiTEGA公司); 甲醇(色譜純, Merck公司); 鹽酸(優(yōu)級(jí)純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 二甲亞砜(色譜純, CNW公司); 2-硝基苯甲醛(純度≥98%, CNW公司); 磷酸氫二鉀(優(yōu)級(jí)純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 乙酸乙酯(色譜純, Merck公司); 乙酸銨(色譜純, Merck公司); 1.5 mL超濾離心管(10 K, Millopore)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

SEM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取適量SEM?HCl標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中, 配制成1.0 mg/mLSEM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, –20 ℃避光保存。SEM-13C,15N2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取適量SEM-13C,15N2標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中, 配制成1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, –20 ℃避光保存。使用時(shí)分別量取適量SEM、SEM-13C,15N2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于棕色容量瓶中, 用甲醇逐級(jí)稀釋, 分別配制成1 μg/mL的SEM標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 ng/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 陽(yáng)性基質(zhì)的制備

將扇貝暴露在含有SEM的海水中進(jìn)行養(yǎng)殖并采集扇貝樣品, 將樣品外殼清洗后開(kāi)殼剝離, 分別取閉殼肌、內(nèi)臟、外套膜、性腺和鰓組織, 勻漿后于–20 ℃避光保存, 用于結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定方法研究。

1.2.3 SEM總量測(cè)定

1.2.3.1 水解和衍生化

稱取扇貝閉殼肌、內(nèi)臟、外套膜、性腺和鰓組織2 g, 置于50 mL離心管中, 準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL, 充分渦旋混合1 min, 再加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL和50 mmol/L 2-硝基苯甲醛溶液150 μL, 充分渦旋混合1 min后, 置于恒溫振蕩器中, 在37 ℃條件下避光振蕩16 h。

1.2.3.2 提取和凈化

將離心管取出并冷卻恢復(fù)至室溫后, 加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液, 調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5。加入8 mL乙酸乙酯, 充分渦旋振蕩1 min, 以8 000 r/min高速離心5 min。轉(zhuǎn)移上層清液至10 mL離心管中, 于40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入5%甲醇溶液1.0 mL, 充分渦旋振蕩溶解殘留物, 再將溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中, 14 000 r/min離心10 min, 取下層清液進(jìn)LC-MS/MS分析。

1.2.4 結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定

稱取扇貝組織2 g于50 mL離心管中, 加入50%甲醇水溶液5 mL, 充分渦旋混合50 s, 超聲波提取5 min, 再以4 000 r/min離心10 min, 棄去上清液。繼續(xù)分別依次加入5 mL 75%甲醇水溶液、5 mL甲醇和5 mL超純水, 重復(fù)上述操作, 棄去上清液, 再按照上述步驟1.2.3處理樣品。

1.2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.5.1 液相色譜條件

Waters Xbridge C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); 流速: 0.35 mL/min; 流動(dòng)相: A. 2 mmol/L乙酸銨溶液, B. 甲醇, 梯度洗脫程序: 0～0.5 min, 90% A; 0.5～4.0 min, 90%～5% A; 4.0～5.5 min, 5% A; 5.5～6.0 min, 5%～90% A; 6.0～7.0 min, 90% A; 進(jìn)樣量: 10 μL; 柱溫: 35 ℃。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

離子源: 電噴霧離子源, 正離子模式; 噴霧電壓: 5 500 V; 氣簾氣: 30 psi; 霧化器: 35 psi; 輔助加熱氣: 35 psi; 離子源溫度: 550 ℃; 碰撞氣: Medium; 掃描模式: 多反應(yīng)選擇監(jiān)測(cè); 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 SEM及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表

注: *為定量碎片離子

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定方法研究

樣品中結(jié)合態(tài)SEM的測(cè)定方法為: 先將游離態(tài)SEM通過(guò)洗滌方式去除, 再將結(jié)合態(tài)SEM水解衍生化測(cè)定。本研究分別以不同極性的洗滌溶劑處理貝類陽(yáng)性基質(zhì)樣品的不同組織, 研究洗滌方式對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。其中, A處理組為未采用洗滌方式處理樣品, 直接測(cè)定SEM總量; B處理組為采用50%甲醇水溶液洗滌1次樣品; C處理組為采用50%甲醇水溶液和75%甲醇水溶液各洗滌1次樣品; D處理組為分別采用50%甲醇水溶液、75%甲醇水溶液和甲醇溶液各洗滌1次樣品; E處理組為分別采用50%甲醇水溶液、75%甲醇水溶液、甲醇溶液和水溶液分別各洗滌1次樣品。B、C、D、E處理組分別采用不同極性試劑處理樣品, 其SEM測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知, 采用B方法處理扇貝組織樣品時(shí), 洗滌1次即可去除閉殼肌、性腺、內(nèi)臟、外套膜和鰓中65.5%、69.3%、34.2%、65.6%、53.7%游離態(tài)SEM。繼續(xù)增加洗滌試劑和洗滌次數(shù), 即可洗滌去除樣品組織中剩余的游離態(tài)SEM, 但SEM含量下降趨勢(shì)減緩。不同處理組間SEM差異比較采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 差異性分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。通過(guò)組間數(shù)據(jù)顯著性差異分析結(jié)果表明, A、B、C、D 4個(gè)處理組間均存在顯著性差異(<0.05), 而D處理組和E處理組間無(wú)顯著性差異(>0.05)。由以上分析可知, 通過(guò)改變洗滌溶劑的極性, 可以去除樣品組織中游離態(tài)SEM, 游離態(tài)SEM在各組織中所占比例較高。當(dāng)采用E處理方法洗滌樣品時(shí), SEM測(cè)定結(jié)果與D處理組無(wú)顯著性差異。因此本實(shí)驗(yàn)采用E處理方法分析扇貝不同組織中結(jié)合態(tài)SEM。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)SEM測(cè)定結(jié)果的影響

基于液質(zhì)聯(lián)用法分析生物樣本的目標(biāo)化合物時(shí), 樣本的一些共同提取物可能對(duì)目標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生增強(qiáng)或者抑制效應(yīng), 即基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)是影響藥物殘留檢測(cè)分析結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因素, 本試驗(yàn)分別對(duì)SEM總量和結(jié)合態(tài)SEM的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。

圖1 不同洗滌方法對(duì)SEM測(cè)定結(jié)果的影響(n=5)

a、b、c、d. 在0.05水平上有顯著性差異; A. SEM總量; B.50%甲醇水; C. 50%甲醇水+75%甲醇水; D. 50%甲醇水+75%甲醇水+甲醇; E. 50%甲醇水+75%甲醇水+甲醇+H2O

a, b, c, d.significant difference (< 0.05); A. Total SEM; B. 50% methanol-water solution; C. 50% methanol-water solution, and 75% methanol-water solution; D. 50% methanol-water solution, 75% methanol-water solution, and methanol solution; E. 50% methanol- water solution, 75% methanol-water solution, methanol solution, and water

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)SEM總量測(cè)定結(jié)果的影響

按照1.2.3的方法處理扇貝組織, 分析基質(zhì)效應(yīng)對(duì)SEM總量測(cè)定結(jié)果的影響?；|(zhì)效應(yīng)(ME)可通過(guò)同濃度提取液中SEM峰面積響應(yīng)值(B)與純?nèi)軇┲蠸EM峰面積響應(yīng)值(A)的比值來(lái)考察, 即ME=B/A。當(dāng)ME>1時(shí), 表示基質(zhì)對(duì)SEM的響應(yīng)具有增強(qiáng)效應(yīng); 當(dāng)ME=1時(shí), 說(shuō)明不存在基質(zhì)效應(yīng); 當(dāng)ME<1時(shí), 則表示基質(zhì)對(duì)SEM的響應(yīng)具有抑制效應(yīng)。SEM及其內(nèi)標(biāo)在純?nèi)芤褐械捻憫?yīng)值見(jiàn)表2, SEM在基質(zhì)提取液中的響應(yīng)值見(jiàn)表3。

由表2和表3可知, 在5種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中, 同濃度SEM的峰面積均小于標(biāo)準(zhǔn)溶液中SEM的峰面積, ME值在0.419～0.751, 說(shuō)明基質(zhì)對(duì)SEM響應(yīng)具有抑制效應(yīng)。而在同濃度下, 基質(zhì)溶液中SEM與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值和標(biāo)準(zhǔn)溶液中SEM與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值基本一致。以SEM與SEM-13C,15N2峰面積的比值為縱坐標(biāo), 以SEM濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合, 擬合后的校正曲線方程見(jiàn)表4。SR表示基質(zhì)匹配校正曲線方程斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線方程斜率的比值。由表4可知, SR值在1.018～1.163, 說(shuō)明即使采用內(nèi)標(biāo)法也不能完全消除基質(zhì)效應(yīng)的影響, 不同基質(zhì)對(duì)SEM總量測(cè)定結(jié)果具有一定程度的影響。因此, 采用基質(zhì)校正曲線定量, 測(cè)定結(jié)果更加精準(zhǔn)。

表2 SEM及其內(nèi)標(biāo)在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)

表3 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)SEM總量測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定結(jié)果的影響

按照1.2.4的方法處理扇貝組織, 通過(guò)基質(zhì)提取液中SEM峰面積與純?nèi)軇┲蠸EM峰面積的比值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)(ME)。

采用1.2.4方法通過(guò)洗滌處理將扇貝組織中的游離態(tài)SEM和雜質(zhì)成分一同去除, 與SEM總量測(cè)定方法相比, 其基質(zhì)效應(yīng)存在差異。由表5可知, 在同一濃度下, 外套膜和鰓基質(zhì)提取液中SEM的響應(yīng)值大于標(biāo)準(zhǔn)溶液中SEM的響應(yīng)值, 因此基質(zhì)對(duì)SEM響應(yīng)具有增強(qiáng)效應(yīng); 而閉殼肌、性腺和內(nèi)臟基質(zhì)提取液中SEM的響應(yīng)值小于標(biāo)準(zhǔn)溶液中SEM的響應(yīng)值, 因此具有基質(zhì)抑制效應(yīng)。由表6可知, SR在0.957～1.035, 說(shuō)明測(cè)定結(jié)合態(tài)SEM時(shí), 內(nèi)標(biāo)法基本消除基質(zhì)效應(yīng)的影響, 采用溶劑校正曲線, 即可準(zhǔn)確定量測(cè)定結(jié)果。

表5 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定結(jié)果的影響

表6 結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定法校正曲線

楊婷婷等[34]對(duì)蛋及蛋制品中硝基呋喃類代謝物的殘留量進(jìn)行分析時(shí), 發(fā)現(xiàn)不同樣品基質(zhì)表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng), 因此在實(shí)際檢測(cè)時(shí)建議采用基質(zhì)加標(biāo)曲線定量。本研究通過(guò)對(duì)SEM總量和結(jié)合態(tài)SEM的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察, 結(jié)果表明, 不同形態(tài)SEM采用不同方式定量, 可使結(jié)果更加精準(zhǔn)。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

SEM的相對(duì)分子質(zhì)量為75, 質(zhì)量數(shù)較小, 在該質(zhì)荷比范圍內(nèi), 質(zhì)譜有較大的背景干擾, 且直接測(cè)定離子化效率低下, 沒(méi)有特征離子碎片, 效果并不理想。通過(guò)衍生化的方法, 可以增加分子質(zhì)量, 降低背景干擾。2-硝基苯甲醛是最常用的衍生化試劑, 2-硝基苯甲醛與SEM的自由氨基團(tuán)衍生化生成硝基苯衍生物, 可增加分子質(zhì)量, 增加離子碎片的選擇性, 從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。將SEM和SEM-13C,15N2標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.3的方法進(jìn)行衍生化和提取, 得到NP-SEM、NP-SEM-13C,15N2標(biāo)準(zhǔn)溶液。SEM的分子中含有氨基, 屬于強(qiáng)極性物質(zhì), 容易形成穩(wěn)定的[M+H]+分子離子, 因此在正離子模式下具有較高的靈敏度。將衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描, 確定分子離子峰。以分子離子峰為母離子進(jìn)行子離子掃描, 并優(yōu)化得到目標(biāo)化合物母離子和子離子所需的碰撞能量、去簇電壓、射入電壓、碰撞室射出電壓等質(zhì)譜參數(shù)。NP-SEM的兩個(gè)子離子中,/196是豐度最大的子離子, 但在其出峰處存在雜質(zhì)干擾, 因此選擇次強(qiáng)碎片離子/166作為定量離子,/196作為定性離子。本方法中NP-SEM、NP-SEM-13C,15N2的母離子、定性離子和定量離子及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.4 凈化條件的選擇

扇貝組織樣品基質(zhì)較為復(fù)雜, 在用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取的操作步驟中, 當(dāng)以4 000 r/min離心時(shí), 萃取液可能會(huì)由于蛋白、脂類等干擾而形成乳化層。將該溶液重新渦旋混勻后, 提高轉(zhuǎn)速, 以8 000 r/min離心, 可有效避免乳化層的形成, 并有利于萃取液的轉(zhuǎn)移。在40 ℃下氮?dú)鉂饪s至干后, 加入5%甲醇水溶液溶解殘?jiān)? 由于基質(zhì)的作用, 可能會(huì)出現(xiàn)渾濁。將待測(cè)液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中, 經(jīng)14 000 r/min超濾離心凈化作用, 雜質(zhì)干擾物質(zhì)與待測(cè)液可實(shí)現(xiàn)較好的分離狀態(tài), 取下層清液進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析, 操作既簡(jiǎn)便快捷, 又可以避免雜質(zhì)干擾, 取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

現(xiàn)有硝基呋喃類代謝物的凈化方法主要有固相萃取凈化[35]、基質(zhì)分散固相萃取凈化[36]等方式。固相萃取凈化方法操作步驟繁瑣, 批量操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而基質(zhì)分散固相萃取凈化方法對(duì)基質(zhì)成分復(fù)雜的樣品, 凈化效果不太理想。本方法采用超濾凈化, 極大簡(jiǎn)化了操作步驟, 又可取得很好的凈化效果。

2.5 方法的靈敏度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法可確定本方法的靈敏度。將SEM標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白貝類組織中, 按照樣品水解、衍生化、提取和凈化等步驟處理樣品, 采用1.2.5的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)LC-MS/ MS分析。當(dāng)添加水平分別為0.5和1.0 μg/kg時(shí), SEM信噪比分別≥3和≥10, 由此確定本方法SEM的檢出限為0.5 μg/kg, 定量限為1.0 μg/kg。扇貝組織中SEM及其同位素內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖2。

2.6 方法的準(zhǔn)確度及精密度

方法的準(zhǔn)確度和精密度分別采用回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。扇貝組織中SEM總量包括游離態(tài)SEM和結(jié)合態(tài)SEM, 結(jié)合態(tài)SEM的測(cè)定方法是先用不同極性的溶劑將組織中的游離態(tài)SEM洗滌去除, 剩余SEM即為蛋白結(jié)合態(tài)SEM, 然后再按照與SEM總量相同的測(cè)定步驟進(jìn)行分析。因此本方法的添加回收率試驗(yàn)是在空白扇貝組織中添加SEM標(biāo)準(zhǔn)溶液, 然后按照SEM總量的測(cè)定方法進(jìn)行添加回收率分析的。在空白扇貝組織中, 按照低、中、高濃度添加SEM, 添加水平分別為1.00、5.00、10.0 μg/kg, 每個(gè)添加水平平行測(cè)定5次, 計(jì)算每種組織的回收率和精密度, 其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

圖2 扇貝閉殼肌中SEM及其同位素內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜圖

表7 扇貝組織中添加SEM的回收率(n=5)

在1.00、5.00和10.0 μg/kg 3個(gè)添加水平下, 測(cè)得SEM的回收率在84.2%～118%, 由此說(shuō)明, 該方法具有良好的準(zhǔn)確度。貝類不同組織在3個(gè)添加水平下分別平行測(cè)定5次, 測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%, 說(shuō)明本方法精密度良好。

2.7 實(shí)際樣品形態(tài)測(cè)定

采用1.2.3和1.2.4建立的方法分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)制備的陽(yáng)性扇貝組織中SEM總量和結(jié)合態(tài)SEM含量進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果表明, 閉殼肌、內(nèi)臟、外套膜、鰓和性腺中結(jié)合態(tài)SEM分別占12.6%、32.5%、18.5%、29.6%、16.6%, 采用該方法可以對(duì)扇貝組織中SEM總量和結(jié)合態(tài)SEM含量進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量測(cè)定。

關(guān)于SEM在水產(chǎn)品中存在形態(tài)的研究報(bào)道目前還較少。VAN等[26]研究了SEM在蝦中的存在形態(tài),羅氏沼蝦()在含50 mg/L呋喃西林的養(yǎng)殖水體中暴露1周, 游離態(tài)SEM和結(jié)合態(tài)SEM均有顯著增加, 肌肉組織中結(jié)合態(tài)SEM約是SEM總量的1/4, 而殼中結(jié)合態(tài)SEM比例超過(guò)65%。舒秀君等[37]研究發(fā)現(xiàn), 日本沼蝦()肌肉和肝胰腺中內(nèi)源性SEM主要以游離態(tài)存在, 而甲殼、眼柄、附肢、頭胸部和鰓組織中內(nèi)源性SEM則主要以結(jié)合態(tài)存在。SEM作為一種海洋環(huán)境污染物, 其在貝類體內(nèi)的存在形式尚不明確, 本文建立了扇貝體內(nèi)SEM存在形態(tài)的測(cè)定方法, 為進(jìn)一步研究環(huán)境污染物SEM在貝類體內(nèi)的存在形態(tài)提供了技術(shù)支撐。

3 結(jié)論

本文研究了扇貝組織中SEM存在形態(tài)的測(cè)定方法, 考察了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)SEM總量和結(jié)合態(tài)SEM測(cè)定結(jié)果的影響, 優(yōu)化了樣品凈化方法, 建立了扇貝中SEM存在形態(tài)的測(cè)定方法, 該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度, 為研究SEM在貝類產(chǎn)品中存在形態(tài)提供了簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)備可靠的技術(shù)方法。

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Determination method of the semicarbazide existing form in scallop

XING Li-hong1, 2, 3, SUN Wei-hong1, 2, 3, ZHU Pan-pan1, 2, 3, SUN Xiao-jie1, 2, 3, LI Zhao-xin1, 2, 3

(1. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, China; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266003, China; 3. Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

In order to clarify the existing form of a new environmental pollutant semicarbazide (SEM) in shellfish, a liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) method was developed to determine the existing form of the environmental pollutant semicarbazide (SEM) in scallop. The total SEM in scallop was determined as follows: After hydrolysis by hydrochloric acid, the sample was derivatized by 2-nitrobenzaldehyde overnight for 16 hours. Then, SEM was extracted with ethyl acetate, purified by ultrafiltration, and analyzed using LC–MS/MS. The tissue-bound SEM was separately washed with methanol/water (50: 50; v/v), followed by methanol/water (75: 25; v/v), methanol, and water. Then, the sample was determined as the method of the total SEM. The SEM residue in the extract was separated on a reversed phase using a gradient elution program of methanol and 2 mmol/L ammonium acetate. Using LC–MS/MS (electrospray ionization, ESI+) with selected reaction monitoring, identification of the major components of the SEM residue was performed based on the fragment intensities. The calibration curve showed good linearity from 0.5–20 μg/L, with a correlation coefficient over 0.999. The recoveries ranged from 84.2% to 118% for the SEM residues, with 3 spiked levels at 1.00, 5.00, and 10.0 μg/kg. The relative standard deviations were less than 15%, and the limit of quantitation for the SEM in scallop tissue was 1.0 μg/kg. The proposed method is sensitive, accurate, and easy to operate, which is suitable for determining the existing form of SEM in scallop.

SEM; high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry; scallop; existing form

Nov. 19, 2021

[Supported by the National Natural Science Foundation of China, No. 41806148; Joint Development Fund Project of Zhejiang Key Lab of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-Resource and Wenzhou Key Laboratory of Marine Biological Genetics and Breeding, No. J2021003; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS, No. 2020TD71]

S912

A

1000-3096(2022)06-0070-10

10.11759/hykx20211119001

2021-11-19;

2022-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41806148); 浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、溫州市海洋生物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合開(kāi)放基金(J2021003); 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020TD71)

邢麗紅(1981—), 女, 山東青島人, 副研究員, 碩士, 主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究, E-mail: xinglh@ysfri.ac.cn; 李兆新(1967—),通信作者, 研究員, E-mail: lizx@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)