張文剛，蘭永麗，黨 斌，張 杰，楊希娟

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)為一年生雙子葉“假谷物”，亦稱南美藜、奎奴亞藜、藜谷等，在我國(guó)山西、青海、西藏、甘肅、云南、浙江、吉林等地均有分布[1]。藜麥富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素、皂苷和多酚等成分，可滿足人體基本的營(yíng)養(yǎng)需求，并在預(yù)防癌癥、心血管疾病、炎癥等方面具有突出優(yōu)勢(shì)，被國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“超級(jí)谷物”[2]。鑒于其食用和藥用價(jià)值，藜麥活性成分的分離純化及功能特性研究、相關(guān)食品開發(fā)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]?；ㄇ嗨?Anthocyanidins)屬于黃酮醇類化合物，色澤鮮亮，無特殊氣味，食用安全，具有清除自由基、護(hù)肝、降血脂、抗突變等特點(diǎn)，是谷物一類重要的天然抗氧化物質(zhì)[4]。藜麥有紅、白、黑等不同粒色，而花青素可能是除甜菜素外賦予籽粒顏色的關(guān)鍵化合物，掌握彩色藜麥花青素的提取與利用對(duì)探究藜麥的保健功能具有重要意義[5]?；ㄇ嗨氐奶崛》椒ㄝ^多，包括溶劑萃取法、酶水解法、樹脂法、超聲萃取法和微波法等[6-8]。其中溶劑萃取法是提取花青素的傳統(tǒng)方法，常選用甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等作為有機(jī)溶劑，鹽酸、磷酸、醋酸、檸檬酸等作為酸化劑。該方法操作簡(jiǎn)單，萃取效率和純度較高，在花青素富集中應(yīng)用廣泛[9-11]。目前，有關(guān)不同粒色藜麥花青素分離提取的研究較少。因此，本研究以青白藜1號(hào)(白藜麥)、青藜2號(hào)(黑藜麥)和貢扎4號(hào)(紅藜麥)為試驗(yàn)材料，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法探討溶劑體系、提取參數(shù)等對(duì)不同粒色藜麥花青素提取的影響，為藜麥花青素的制備和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青白藜1號(hào)(白藜麥)、青藜2號(hào)(黑藜麥)和貢扎4號(hào)(紅藜麥)由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物所提供；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；醋酸鈉、醋酸、氯化鉀、鹽酸、磷酸、檸檬酸、乳酸、硫酸、乙酸、甲醇、無水乙醇、丙酮等(天津科密歐試劑公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

FW200高速中藥粉碎機(jī)(天津華鑫儀器廠)；N4S型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；SHA-C型恒溫振蕩器(國(guó)華電器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花青素的提取 藜麥籽粒除雜、清洗后45 ℃烘干，粉碎過60目篩。稱取1.000 g藜麥粉置于50 mL離心管，加入酸化乙醇，混合均勻后在一定溫度下浸提，12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，收集上清液。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 以花青素提取量為指標(biāo)，探討溶劑(水、60%甲醇、60%乙醇、60%丙酮，V/V)、溶劑體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)、酸化劑(鹽酸、磷酸、檸檬酸、乳酸、硫酸、乙酸，4 mol/L)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24 g/mL)、浸提溫度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)及浸提時(shí)間(20、40、60、90、120、150、180 min)對(duì)提取藜麥花青素的影響。各因素固定條件：60%乙醇，鹽酸，pH 4.0，料液比1∶4 g/mL、浸提溫度50 ℃，浸提時(shí)間60 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以藜麥花青素提取量為響應(yīng)值，選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間為因素，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行Box-Behnken三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 Design of factors and levels of response surface test

1.3.4 藜麥花青素含量的測(cè)定 利用雙波長(zhǎng)pH示差法[12]測(cè)定花青素含量。取1 mL花青素提取液，加入9 mL 0.4 mol/L、pH 4.5的NaAc-HAc緩沖液或0.25 mol/L、pH 1.0的KCl-HCl緩沖液，混合均勻后倒入1 mL比色皿，以蒸餾水替代樣品作空白對(duì)照，分別在510 nm和700 nm下測(cè)定光密度(optical density，OD)。

花青素提取量(μg/g)=A×Mw×DF×V/(ε×1×W)

式中：A=(OD510 nm，pH 1.0-OD700 nm，pH1.0)-(OD510 nm，pH 4.5-OD700 nm，pH 4.5)，Mw為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量 449.2 g/mol，DF為待測(cè)液稀釋倍數(shù)，V是提取液體積(mL)，ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)26 900 L/(mol·cm)，W為藜麥粉干重(g)。

1.3.5 紅外光譜分析 采用KBr壓片法[10]測(cè)試藜麥花青素紅外光譜。取藜麥花青素提取物粉末與干燥KBr混合均勻，壓片后在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)、分辨率4 cm-1條件下掃描紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的影響 由圖1a可知，藜麥粒色不同，所適宜的酸化劑也有差異。白藜麥提取量為乙酸>硫酸>磷酸，黑藜麥提取量為磷酸>檸檬酸>乳酸，紅藜麥提取量為檸檬酸>乳酸>磷酸。為便于操作，選擇對(duì)三種粒色藜麥花青素提取量均較高的磷酸作為優(yōu)選酸化劑。由圖1b看出，不同溶劑對(duì)藜麥花青素提取效果均表現(xiàn)為乙醇>甲醇>丙酮>水，乙醇顯著高于其他溶劑(P<0.05)。因此，選擇乙醇溶液作為最適提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)花青素提取量的影響Fig.1 Effects of extraction solvent on anthocyanins extraction

2.1.2 不同提取條件的影響 由圖2a可知，藜麥花青素提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)藜麥花青素提取量達(dá)到最大值。圖2b表明，藜麥花青素提取量隨著溶劑pH的升高而降低，pH為3.0時(shí)花青素提取量最大。圖2c表明，藜麥花青素提取量隨料液比的減小先增大后減小，料液比為1∶6 g/mL時(shí)效果最佳。圖2d表明，藜麥花青素提取量隨溫度的升高先增大后減小，50 ℃時(shí)提取量最大。圖2e表明，藜麥花青素提取量隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，浸提時(shí)間為120 min時(shí)提取量最大。

圖2 提取參數(shù)對(duì)花青素提取量的影響Fig.2 Effects of extraction parameters on anthocyanins extraction

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合并在α=0.05水平剔除不顯著項(xiàng)，得出藜麥花青素提取量與各編碼因素間的方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface test

白藜麥：YW=49.61-1.51X2+2.93X1X2-3.00X2X3-4.82X12-2.41X22-3.92X32

黑藜麥：YB=51.82+1.26X1-2.03X2+1.63X3-2.08X1X3-2.75X12-3.72X22-3.27X32

紅藜麥：YR=49.73+1.76X1-1.05X2+1.51X2X3-3.98X12-3.06X22-1.71X32

由表3可知，不同粒色藜麥花青素提取擬合模型的P<0.01，表明建立的模型極顯著。失擬項(xiàng)均不顯著(P>0.05)，方程擬合度高。模型R2為0.954 1～0.964 4，說明響應(yīng)值的95.41%～96.44%來自所選變量。RAdj2為0.871 5～0.900 3，說明模型可解釋87.15%～90.03%的響應(yīng)值變化。C.V.值為2.50%～3.46%，表明試驗(yàn)受外界因素影響較小。根據(jù)一次項(xiàng)P值可知，各因素影響主次順序具體為X2>X3>X1(白藜麥)、X2>X3>X1(黑藜麥)、X1>X2>X3(紅藜麥)。

表3 二次模型方差分析Tab.3 Variance analysis of quadratic model

表3(續(xù))

2.2.2 交互作用分析 由圖3可知，藜麥花青素提取量隨料液比、浸提溫度和時(shí)間的增大先增大后減小，效應(yīng)曲面均較陡。由圖3A、圖3B、圖3C可知，溫度對(duì)效應(yīng)曲面的影響更明顯，依次為浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比，與表3結(jié)果一致。由圖3D、圖3E、圖3F浸提溫度對(duì)效應(yīng)曲面彎曲程度的影響最大，控制好浸提溫度對(duì)黑藜麥花青素提取較為關(guān)鍵。從圖3G、圖3H、圖3I看出，料液比對(duì)紅藜麥花青素提取量的影響最大，表現(xiàn)為圖3G和圖3H曲面陡峭，圖3C較為平緩，各因素影響順序?yàn)榱弦罕?浸提溫度>浸提時(shí)間。此外，由圖3A～圖3I的等高線形狀和密集度可知，白藜麥X1X2交互作用明顯，X2X3次之；圖E中橢圓明顯，表明黑藜麥X1X3交互作用顯著；紅藜麥X2X3交互作用顯著。

圖3 各因素交互作用對(duì)三種粒色藜麥花青素提取量的影響Fig.3 Effects of interaction of various factors on anthocyanins extraction from three colors of Chenopodium quinoa Willd.

2.2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 由回歸方程預(yù)測(cè)的白藜麥、黑藜麥、紅藜麥花青素最佳提取參數(shù)分別為料液比6.25∶1、6.69∶1、7.11∶1 mL/g，浸提溫度46.10、47.40、47.66 ℃，浸提時(shí)間90.78、98.92、86.29 min，預(yù)測(cè)提取量49.88、52.34、49.47 μg/g。為便于操作，將各參數(shù)修正為料液比6.3∶1、6.7∶1、7.0∶1 g/mL，浸提溫度49.0、47.0、48.0 ℃，提取時(shí)間90、100、85 min，得到3種粒色藜麥花青素平均提取量為49.15、52.27、49.06 μg/g，與響應(yīng)預(yù)測(cè)值基本接近，表明建立的模型可行。

2.3 紅外光譜分析

由圖4可知，藜麥花青素提取物的紅外光譜特征峰基本一致，集中在800～500 cm-1指紋區(qū)和1 700～1 000 cm-1高頻區(qū)。3 376 cm-1的強(qiáng)吸收由花青素分子中締合態(tài)酚羥基產(chǎn)生，2 926 cm-1處為飽和—C—H的反對(duì)稱伸縮，對(duì)應(yīng)烷基—CH3，而2 855 cm-1處是飽和—C—H的對(duì)稱伸縮，對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)為—CH2；1 680～1 450 cm-1是芳香環(huán)的飽和骨架振動(dòng)，1 728 cm-1的吸收峰由C=O 引起，1 300～1 000 cm-1屬于醇、酚等C—O的伸縮振動(dòng)，其中1 055 cm-1和1 236 cm-1可能是花青素分子中C—O—C的伸縮振動(dòng)980～650 cm-1的吸收峰由O—H的面內(nèi)外彎曲振動(dòng)引起[10，13]。綜上所述，藜麥花青素是具有醇羥基和酚羥基的芳環(huán)結(jié)構(gòu)化合物。

圖4 藜麥花青素提取物的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of anthocyanins extract from Chenopodium quinoa Willd.

3 討論與結(jié)論

研究藜麥花青素的提取可為藜麥資源的功能化開發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)，前人主要對(duì)藜麥中甜菜素類色素成分做了初步探究。Escribano等[14]發(fā)現(xiàn)4種甜菜黃素是橙黃色藜麥籽粒顏色形成的重要原因。Laqui-Vilca等[15]優(yōu)化了藜麥殼中甜菜花青素和甜菜黃素的超聲輔助提取工藝。除甜菜素外，花青素也是賦予籽粒顏色特征的關(guān)鍵成分，但目前有關(guān)藜麥花青素的提取和分析鮮有研究。因此，本文以青白藜1號(hào)(白藜麥)、青藜2號(hào)(黑藜麥)和貢扎4號(hào)(紅藜麥)為試驗(yàn)材料，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析探討溶劑體系、提取參數(shù)等對(duì)藜麥花青素提取影響，并得到如下結(jié)論：

(1)三種不同粒色藜麥中，黑藜麥花青素更為豐富。影響白藜麥和黑藜麥花青素提取量的因素主次順序?yàn)榻釡囟取⒔釙r(shí)間和料液比，而影響紅藜麥花青素提取量的因素主次順序?yàn)榱弦罕?、浸提溫度和浸提時(shí)間。

(2)優(yōu)化得到的藜麥花青素提取條件為磷酸作酸化劑、70% pH 3.0的乙醇作溶劑、料液比6.3～7.0 g/mL、浸提溫度47～49 ℃、浸提時(shí)間85～100 min，花青素提取量達(dá)到49.06～52.27 μg/g，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致。