黃浪浪，徐 驲，劉言薇，王建安，萬 強(qiáng)，劉中勇

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西 南昌 330004； 2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是指人體感染新型冠狀病毒而引起的急性肺炎，是一種具有強(qiáng)傳染性、易于流行的呼吸系統(tǒng)疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織實(shí)時統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截至北京時間2021年4月22日7時，全球確診COVID-19人數(shù)超1.44億例，累計(jì)死亡病例超307萬例，目前全球已有24個國家COVID-19確診病例超過100萬例[1]。該病早期會引起發(fā)熱、干咳、乏力等一般癥狀，嚴(yán)重者甚至可以導(dǎo)致呼吸衰竭或膿毒癥休克，危及生命。目前治療該疾病以中西醫(yī)結(jié)合對癥治療為主，無抗病毒的特效藥物和疫苗。在此期間，中醫(yī)藥在COVID-19治療中發(fā)揮著重要作用，具有明顯療效。新型冠狀病毒在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“疫病”“瘟疫”等范疇，在國家衛(wèi)生健康委員會修訂的第四版至第八版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》[2-6]中對于醫(yī)學(xué)觀察期中的乏力伴發(fā)熱患者都推薦使用金花清感顆粒(JHQGKL)、連花清瘟顆粒(LHQWKL)和疏風(fēng)解毒顆粒(SFJDKL)3種中成藥(以下簡稱“三方”)。雖然此三方療效確切，但其作用于COVID-19的分子機(jī)制尚未完全清楚，且較少對三方治療疾病的機(jī)制進(jìn)行共性與比較研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)手段，通過構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)對中藥復(fù)方進(jìn)行分析，以了解藥物對疾病的影響情況，與中醫(yī)的整體觀念相吻合。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對三方構(gòu)建多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，挖掘三方治療COVID-19的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供理論依據(jù)。

1 對化合物-靶點(diǎn)-通路-療效相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索

1.1 三方藥物活性化合物的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)的檢索功能，以金花清感顆粒中“金銀花、連翹、麻黃、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷、黃芩、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿”，連花清瘟顆粒中“金銀花、連翹、麻黃、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷、板藍(lán)根、貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天”，疏風(fēng)解毒顆粒中“虎杖、連翹、板藍(lán)根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草”為關(guān)鍵詞，獲取三方中藥活性成分信息。并將毒藥物動力學(xué)參數(shù)設(shè)置為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug likeness, DL)≥0.18進(jìn)行篩選，獲取三方中的主要活性成分群。

1.2 三方中活性化合物作用靶點(diǎn)和COVID-19疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

通過TCMSP、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)和Uniport(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測并篩選出符合1.1標(biāo)準(zhǔn)的作用靶點(diǎn)，并將其蛋白和基因信息標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)基因簡稱。應(yīng)用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“novel coronavirus pneumonia”“viral pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)。隨后運(yùn)用Venny平臺篩選出藥物主要活性成分與疾病的共同靶點(diǎn)，得到三方治療COVID-19的靶點(diǎn)。

1.3 三方治療COVID-19共有靶標(biāo)蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)及網(wǎng)絡(luò)可視化的構(gòu)建

將三方中活性化合物預(yù)測得到的靶點(diǎn)與COVID-19的疾病靶點(diǎn)相映射，分別得到三方與疾病的交集靶點(diǎn)。然后對三方的交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析得到共有的靶點(diǎn)，將其輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并將結(jié)果可視化。

1.4 三方治療COVID-19“重要活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

分別將得到的三方中的活性化合物、潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件中，設(shè)置節(jié)點(diǎn)度值(Degree)≥20為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，構(gòu)建“重要活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 靶點(diǎn)功能富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)上傳三方中中藥對COVID-19作用的靶點(diǎn)基因名稱，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作進(jìn)行 GO富集(包括分子功能、生物過程和細(xì)胞成分)和 KEGG通路富集分析。

1.6 三方抗COVID-19療效驗(yàn)證

中藥抗COVID-19藥效預(yù)測分析平臺TCMATCOV(http://tcmatcov.bbtcml.com/)是由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥新藥設(shè)計(jì)課題組和北京蛋白質(zhì)組研究中心生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)課題組聯(lián)合開發(fā)，用于預(yù)測單味中藥及中藥復(fù)方抗COVID-19療效的平臺?；赥CMATCOV平臺，將蛋白質(zhì)相互作用置信分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.5，陰性對照方劑選擇半夏白術(shù)天麻湯，陽性對照選擇化濕敗毒顆粒，對三方抗COVID-19疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行穩(wěn)健性分析。

2 對數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進(jìn)行分析

2.1 三方活性化合物的篩選

從TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫平臺檢索到金花清感顆粒、連花清瘟顆粒、疏風(fēng)解毒顆粒分別有1 817個、1 743個、1 151個化合物。經(jīng)OB值和DL值篩選后得到主要活性化合物分別為209個、208個、179個，其中120個為三方共同主要活性化合物(圖1)。

JHQGKL：金花消感顆粒；LHQWKL：連花清瘟顆粒；SFJDKL：疏風(fēng)解毒顆粒。圖1 三方活性化合物韋恩圖

2.2 三方治療COVID-19共有靶點(diǎn)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)TCMSP、Uniport數(shù)據(jù)庫得到金花清感顆粒、連花清瘟顆粒、疏風(fēng)解毒顆粒潛在作用靶點(diǎn)分別為139個、132個、129個。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到3 476個COVID-19的治療靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny平臺對三方相關(guān)治療靶點(diǎn)取交集，其中金花清感顆粒治療COVID-19靶點(diǎn)最多，為101個；其次是連花清瘟顆粒和疏風(fēng)解毒顆粒，分別為94個和92個。再將三方治療靶點(diǎn)取交集，共得到92個靶點(diǎn)(圖2)。將三方中共有的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再將得到的結(jié)果輸入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。網(wǎng)絡(luò)中(圖3)共有92個節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn))，937條邊(邊表示靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系)，平均節(jié)點(diǎn)度值為20.4，節(jié)點(diǎn)大小代表度值高低，有35個靶點(diǎn)超過平均度值，聚類系數(shù)為0.596，網(wǎng)絡(luò)中心勢為0.423，將Degree前10個基因作為關(guān)鍵基因(表1)。

JHQGKL：金花消感顆粒；LHQWKL：連花清瘟顆粒；SFJDKL：疏風(fēng)解毒顆粒。圖2 三方治療COVID-19靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 三方治療COVID-19共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 三方治療COVID-19共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.3 三方治療COVID-19“重要活性化合物-靶點(diǎn)”圖

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件以節(jié)點(diǎn)Degree≥20為篩選標(biāo)準(zhǔn)提取子網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建三方重要活性化合物與COVID-19疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，MOL000098(槲皮素)可作用于MAPK14、ACHE等多個靶點(diǎn)，ACHE靶點(diǎn)又能與槲皮素、MOL000422(山柰酚)等多個化合物相連。這反映了中藥治療疾病具有多重效應(yīng)的特點(diǎn)[7]。通過“重要活性化合物-靶點(diǎn)”圖比較發(fā)現(xiàn)，三方中以金花清感顆粒治療COVID-19的重要活性化合物和作用靶點(diǎn)最多(化合物38個，靶點(diǎn)31個)，其次是連花清瘟顆粒(化合物33個，靶點(diǎn)30個)和疏風(fēng)解毒顆粒(化合物24個，靶點(diǎn)30個)(圖4～6)。

圖4 金花清感顆?！爸匾钚曰衔?靶點(diǎn)”圖

圖5 連花清瘟顆?！爸匾钚曰衔?靶點(diǎn)”圖

圖6 疏風(fēng)解毒顆?！爸匾钚曰衔?靶點(diǎn)”圖

2.4 靶點(diǎn)通路分析

將靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，其中金花清感顆粒、連花清瘟顆粒、疏風(fēng)解毒顆粒得到GO條目(P<0.05)依次為359個、348個和326個。KEGG通路富集篩選得到金花清感顆粒中符合條件的作用于COVID-19的通路有144條(P<0.05)，連花清瘟顆粒139條，疏風(fēng)解毒顆粒140條。在靶基因富集最多的前10條通路中，三方均與PI3K-Akt、MAPK 、IL-17、TNF信號通路密切相關(guān)(圖7～9)。

圖7 金花清感顆粒治療COVID-19的通路氣泡圖

圖8 連花清瘟顆粒治療COVID-19的通路氣泡圖

圖9 疏風(fēng)解毒顆粒治療COVID-19的通路氣泡圖

2.5 三方對COVID-19治療效果的預(yù)測

運(yùn)用TCMATCOV V1.0平臺對三方干擾COVID-19疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性進(jìn)行評價分析，其中網(wǎng)絡(luò)平均連接度為網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)連接度的平均值，數(shù)值越大則網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，負(fù)值說明藥物對于疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定破壞力強(qiáng)。網(wǎng)絡(luò)平均最短路徑為網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑長度的平均值，數(shù)值越小網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，正干擾率說明藥物對于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性有破壞作用。連接度中心性和緊密度中心性分別由所有節(jié)點(diǎn)的連接度中心性和所有節(jié)點(diǎn)的緊密度中心性計(jì)算而來，因此這兩個指標(biāo)數(shù)值越大網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，其負(fù)擾動率越大則藥物對于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定破壞力越強(qiáng)。綜合以上4個數(shù)值的擾動率總評分，從整體上評估了藥物對于COVID-19疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的干擾程度，其數(shù)值越高，則藥物對于疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的破壞程度越高[8]。綜合評價，金花清感顆粒、連花清瘟顆粒和疏風(fēng)解毒顆粒擾動率總評分分別為18.05、21.60和20.84，與陽性對照組方劑化濕敗毒顆粒臨床療效非常接近(表2)。

表2 藥物干預(yù)疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性評價

3 討論

目前認(rèn)為本病的病因?yàn)楦惺堋耙哽濉敝畾?，病位在肺、脾，病機(jī)核心為濕、毒?，F(xiàn)代研究證明[9-11]，三方具有抗病毒、抗炎、解熱和調(diào)節(jié)免疫的作用；同時三方對于治療COVID-19、病毒性肺炎具有較好的臨床療效，能有效地改善患者發(fā)熱、乏力、咳嗽、咳痰等臨床癥狀[12-16]。金花清感顆粒、連花清瘟顆粒均由銀翹散、麻杏石甘湯加減化裁而來，兩方中均含有金銀花、連翹、麻黃、石膏、苦杏仁、甘草、薄荷，具有清熱解毒、辛涼宣肺之功；此外，金花清感顆粒含有的黃芩、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿可清熱瀉火、化痰利咽；連花清瘟顆粒含有的板藍(lán)根、貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天可健脾化濕、活血通腑。疏風(fēng)解毒顆粒中虎杖、敗醬草、馬鞭草清熱利濕、散結(jié)消腫，連翹、板藍(lán)根清熱解毒，柴胡解肌退熱，蘆根生津防津液耗傷太過，甘草調(diào)和諸藥，共奏疏風(fēng)清熱、解毒利咽之功。三方均具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效，但目前對三方之間的共性和比較研究相對較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，三方中含有共同化合物120個，共同治療靶點(diǎn)92個。MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷甾醇)和MOL000449(豆甾醇)在三方網(wǎng)絡(luò)中度值高，可能是三方發(fā)揮治療作用的重要共性化合物。將三方主要活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與COVID-19的治療靶點(diǎn)取交集，度值排名前10的靶點(diǎn)有IL-6、MAPK3、VEGFA、JUN、EGF、EGFR、MAPK1、PTGS2、MAPK8、IL-1β。IL-6和IL-1β都是白細(xì)胞介素家族成員，屬于細(xì)胞因子的一種，由免疫細(xì)胞所分泌，參與體內(nèi)的免疫和炎癥反應(yīng)。當(dāng)體內(nèi)的免疫反應(yīng)過度激活時，則會引起免疫激化，導(dǎo)致體內(nèi)大量炎癥因子過度表達(dá)，從而形成細(xì)胞因子風(fēng)暴[17]。相關(guān)研究表明[18-19]，COVID-19患者的嚴(yán)重程度和細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)，而IL-6在細(xì)胞因子風(fēng)暴中發(fā)揮著重要作用。VEGFA、JUN、EGF、EGFR和PTGS2等都參與肺纖維化的病變過程。VEGF一方面能通過與血管內(nèi)皮生長因子受體相結(jié)合介導(dǎo)血管的生成，為細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維的合成提供營養(yǎng)，從而加重纖維化；另一方面能激活VEGF/p-Junk信號通路，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生腫脹，影響肺的換氣功能[20-21]。

通過富集分析發(fā)現(xiàn)，金花清感顆粒治療COVID-19所涉及的分子機(jī)制最多，且與連花清瘟顆粒以及疏風(fēng)解毒顆粒相比，其與PI3K-Akt及MAPK 信號通路關(guān)系最為密切。PI3K-Akt和MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路，能調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、黏附、侵襲和凋亡，對于治療呼吸系統(tǒng)疾病、病毒感染具有重要作用[22-23]。據(jù)報道[24-25]，細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt信號通路是病毒吞噬和復(fù)制所必需的，幾乎所有DNA和RNA病毒都會對該通路進(jìn)行調(diào)控，以調(diào)節(jié)病毒的活力，實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染以及介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Akt是PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵分子，活化的Akt能激活下游信號分子，對細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控。一些PI3K或其下游信號Akt的抑制劑可以通過抑制細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白的磷酸化，從而抑制PI3K-Akt信號通路的激活，阻斷病毒的感染和復(fù)制。MAPK信號通路是有效的核蛋白復(fù)合體，為細(xì)胞核輸出和合成病毒所必需，MAPK通路的抑制劑可以減少病毒復(fù)制和炎癥癥狀[26-27]。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對目前臨床常用的早期治療COVID-19的中成藥進(jìn)行了多層次分析，發(fā)現(xiàn)三方對COVID-19均有治療作用。與連花清瘟顆粒和疏風(fēng)解毒顆粒兩方相比，金花清感顆粒重要活性化合物、靶點(diǎn)及作用通路更多，但三方療效還需進(jìn)一步臨床觀察與基礎(chǔ)研究。同時由于對相關(guān)參數(shù)的設(shè)置篩選，導(dǎo)致本研究并未對COVID-19入侵研究較明確的靶點(diǎn)ACE2、CD147等進(jìn)行探討，但在一定程度上為臨床三方的運(yùn)用以及深入研究提供了思路。