艾 林，李 愷，徐 娜，高 鵬，張若冰

(空軍第九八六醫(yī)院： 1口腔科， 2皮膚整形科，陜西 西安 710054； 3陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065)

慢性牙周炎是一種以牙周支持組織炎癥性破壞為特征的疾病，破壞的嚴(yán)重程度取決于細(xì)菌的種類及數(shù)量、宿主對(duì)細(xì)菌感染先天免疫的遺傳因素和環(huán)境因素之間的動(dòng)態(tài)平衡?？谇痪河煽谇簧掀ぜ?xì)胞、唾液和齦溝液參與的免疫反應(yīng)調(diào)控，蛋白質(zhì)和抗菌肽也參與這種局部防御機(jī)制[1]。人類唾液和齦溝液含有多種抗菌肽，其結(jié)構(gòu)上含有陽(yáng)離子肽、酶和凝集蛋白，陽(yáng)離子肽α-防御素人類中性粒細(xì)胞肽(human neutrophil peptide，HNP)是最具特征的抗菌分子，與多形核白細(xì)胞遷移有關(guān)。防御素參與宿主的免疫反應(yīng)，能夠殺死革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌、真菌和一些病毒[2]。此外，它們還可以刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活，并增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能，在預(yù)防和根除感染方面起著重要作用[3-4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，包括HNP1-3在內(nèi)的抗菌肽具有免疫調(diào)節(jié)特性[5]。但HNP參與牙周組織免疫過(guò)程的機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

我國(guó)高原面積廣闊，戰(zhàn)略地位重要。在高原環(huán)境下，口腔疾病的患病率顯著高于其他地區(qū)，嚴(yán)重影響官兵的健康和作戰(zhàn)效率[6]。有研究表明，70%的官兵患有不同程度的牙周病[7]。本研究的目的是評(píng)估高原駐訓(xùn)官兵牙周基礎(chǔ)治療后牙周臨床指數(shù)、齦溝液中HNP1-3水平以及口腔菌群的變化，從而了解牙周基礎(chǔ)治療對(duì)于高原駐訓(xùn)官兵牙周健康的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年4月至2019年11月在格爾木西大灘地區(qū)(4 400 m)駐訓(xùn)的無(wú)全身系統(tǒng)性疾病的官兵50名(均為男性)，年齡(25.5±6.2)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：影響牙周治療的嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病(心腦血管疾病、中風(fēng)、糖尿病、呼吸道感染等)；治療前6個(gè)月接受全身抗生素治療；對(duì)硝唑類和/或青霉素類藥物過(guò)敏。納入條件：牙齦炎或輕、中度牙周炎(牙周袋≤6 mm，附著喪失≤4 mm，X線片顯示牙槽骨水平型或角型吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/3，但不超過(guò)根長(zhǎng)的1/2。牙齒可能有輕度松動(dòng)，多根牙的根分叉區(qū)可能有輕度病變，牙齦有炎癥和探診出血，也可有膿)；3個(gè)月內(nèi)未做口腔治療；不吸煙。受試官兵統(tǒng)一培訓(xùn)巴氏刷牙法。所有病例都被告知了這項(xiàng)研究，并提供了書面同意書。這項(xiàng)研究得到了空軍第986醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)后實(shí)施(許可證號(hào)：20190037)。

1.2 主要材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)菌株(空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó))；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、引物(Sigma公司，美國(guó))；菌斑染色劑、ELISA試劑盒(Gibco公司，美國(guó))；Whatman濾紙(Whatman公司，英國(guó))；UNC 15牙周探針、超聲波潔牙機(jī)(Hu Friedy公司，美國(guó))；LM超聲波定標(biāo)器(Parainen公司，芬蘭)；Periotron 8000校準(zhǔn)裝置(Oraflow公司，美國(guó))；酶聯(lián)檢測(cè)儀、自動(dòng)凝膠成像分析儀(Nikon公司，日本)。

1.3 口腔檢查與采集樣本

在治療前(基線檢查)以及治療后的3個(gè)月和7個(gè)月，使用相同類型的UNC 15牙周探針進(jìn)行牙周檢查，并記錄探診深度、牙齦退縮、菌斑指數(shù)和探診出血、臨床附著水平測(cè)量值。從頰側(cè)近中、中部、遠(yuǎn)中，舌側(cè)近中、中部、遠(yuǎn)中6個(gè)部位對(duì)采集的牙進(jìn)行探診深度、牙齦退縮、臨床附著水平、探診出血檢測(cè)，在頰側(cè)近中、中部、遠(yuǎn)中和舌側(cè)4個(gè)標(biāo)志點(diǎn)測(cè)定菌斑指數(shù)?？谇粰z查由同一名資深主治醫(yī)師執(zhí)行。

在基線檢查、治療3個(gè)月和7個(gè)月時(shí)分別收集齦溝液，并用相對(duì)Periotron單位測(cè)定齦溝液流速。用棉卷隔離牙齒，輕輕去除牙菌斑，并吹干牙齒。將Whatman濾紙放置在牙周袋中1～2 mm深度處?kù)o置30 s，如血液污染則丟棄濾紙。使用Periotron 8000校準(zhǔn)裝置測(cè)量紙條上吸收的齦溝液體積并稱質(zhì)量。測(cè)量后，立即將樣品置于含有20 μL PBS的Eppendorf試管中，并于-70 ℃冰箱冷凍。

1.4 牙周基礎(chǔ)治療及復(fù)查

由一名資深主治醫(yī)師使用LM超聲波定標(biāo)器和超聲波潔牙機(jī)進(jìn)行全面的口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、齦上潔治、齦下刮治和拋光，必要時(shí)1周后進(jìn)行根面平整?？谇恍l(wèi)生指導(dǎo)如下：每日飯后使用牙線或/和牙間隙刷，每日至少刷牙2次。

1.5 測(cè)定HNP1-3含量

根據(jù)ELISA生產(chǎn)商的說(shuō)明書，使用試劑盒測(cè)定齦溝液中HNP1-3的濃度。HNP1-3的最低檢出量為0.156 μg/L。

1.6 牙周致病菌的檢測(cè)

駐訓(xùn)結(jié)束后使用無(wú)菌刮匙刮取受試官兵下頜切牙齦袋底的齦下菌斑，放入EP管內(nèi)，加入0.01 mol/L PBS高速離心(10 000 r/min)10 min后，棄上清提取沉淀DNA。自行設(shè)計(jì)、合成引物，采取PCR技術(shù)對(duì)齦下菌斑DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以5種標(biāo)準(zhǔn)菌株：牙齦卟啉單孢菌、福賽氏類桿菌、中間普氏菌、齒垢密螺旋體和伴放線放線桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，以變異鏈球菌(ATCC 27607)為陰性對(duì)照，在瓊脂糖凝膠電泳后于紫外線檢測(cè)儀下觀察擴(kuò)增帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)性分布采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，非正態(tài)性分布采用不等距重復(fù)測(cè)量的方差分析。采用Spearman秩和檢驗(yàn)分析每個(gè)測(cè)量點(diǎn)HNP1-3含量與牙周臨床指數(shù)、溝液流速的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周臨床指數(shù)變化

牙周基礎(chǔ)治療使樣本在不同采集時(shí)間點(diǎn)的臨床評(píng)估指數(shù)(探診深度、臨床附著水平、菌斑指數(shù)、齦溝液流速)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善(P<0.01)，而探診出血的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 不同采樣時(shí)間點(diǎn)牙周臨床指數(shù)變化

bP<0.01vs基線。

2.2 HNP1-3水平變化

HNP1-3基線值[(99±11)ng]與治療3個(gè)月[(139±15)ng]和7個(gè)月[(145±18)ng]時(shí)的測(cè)量值比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，3個(gè)月和7個(gè)月時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。齦溝液量基線值[(4.3±0.6)μg]與治療3個(gè)月[(2.6±0.4)μg]和7個(gè)月[(2.1±0.6)μg]時(shí)的測(cè)量值比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，3個(gè)月和7個(gè)月時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

對(duì)HNP1-3、齦溝液流速、探診深度和臨床附著水平之間的相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：7個(gè)月后，臨床附著水平與齦溝液流速呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.519)；探診深度與齦溝液流速呈正相關(guān)(r=0.462)；HNP1-3水平與臨床附著水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.473)。

2.3 五種牙周致病菌的檢出情況變化

五種牙周致病菌在官兵治療7個(gè)月時(shí)檢出率明顯低于基線(P<0.05，表2)。

表2 五種牙周致病菌的檢出情況變化 [n(%)]

3 討論

高原環(huán)境下，口腔疾病的患病率明顯高于其他地區(qū)，對(duì)駐訓(xùn)官兵開展積極的口腔疾病預(yù)防工作有著重大戰(zhàn)略意義。牙周病是導(dǎo)致成人牙齒喪失的主要原因，嚴(yán)重影響口腔健康。并且在日常訓(xùn)練、執(zhí)行任務(wù)及戰(zhàn)斗時(shí)，牙周病帶來(lái)的口腔問(wèn)題，嚴(yán)重影響官兵的生活質(zhì)量，會(huì)大大削弱官兵的戰(zhàn)斗力。因此，對(duì)于口腔健康保障維護(hù)方法的研究，對(duì)我軍一線部隊(duì)顯得尤為重要。

口腔是一個(gè)復(fù)雜的微生物環(huán)境，大約包含700種不同的細(xì)菌，其中一部分與人體構(gòu)成共生菌群，而另一些則具有潛在致病性。菌群由口腔上皮細(xì)胞、唾液和齦溝液的先天免疫反應(yīng)控制，此外蛋白質(zhì)和抗菌肽也參與這種局部防御機(jī)制[8]。陽(yáng)離子肽、酶和大的凝集蛋白是保護(hù)口腔內(nèi)環(huán)境必不可少的物質(zhì)，陽(yáng)離子肽包括腎上腺髓質(zhì)素、α-防御素、β-防御素、組織蛋白酶、天青酸、降鈣素相關(guān)肽、神經(jīng)肽Y、物質(zhì)P和血管活性腸肽[9]。而防御素是最具特征的抗菌分子，但其在免疫機(jī)制中的作用尚未明確。α-防御素(HNP1-4)位于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中，而HNP5-6則存在于腸潘氏細(xì)胞中[10-11]。α-防御素在口腔中存在于唾液腺、唾液以及齦溝液中，與多形核白細(xì)胞遷移有關(guān)。

防御素參與宿主的先天免疫，能夠殺死革蘭細(xì)菌、真菌和一些病毒，通過(guò)CD4+T細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)先天性和獲得性免疫反應(yīng)，并且刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能[12]。然而，它們?cè)谌梭w免疫中的作用尚未完全闡明。有研究表明[13]，HNP1-3抗菌肽具有免疫調(diào)節(jié)特性，但其參與牙周組織先天性和獲得性免疫的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

HNP占中性粒細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的5%～7%，殺菌作用與細(xì)胞膜中通道的形成以及細(xì)菌的半透性變化相關(guān)，這種非特異性的作用可以導(dǎo)致自身細(xì)胞的破壞，是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織破壞機(jī)制的一部分[14]。HNP1能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、附著和擴(kuò)散，而高劑量則會(huì)增加細(xì)菌附著和角質(zhì)形成細(xì)胞的死亡。HNP還具有免疫調(diào)節(jié)特性[15]。此外，在高濃度下，它們對(duì)腫瘤和真核細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，會(huì)造成DNA損傷和腫瘤細(xì)胞溶解[16]。細(xì)菌感染可增強(qiáng)口腔炎癥患者的唾液中α-防御素的表達(dá)[11]。

本研究結(jié)果顯示，官兵在基線、術(shù)后3個(gè)月和7個(gè)月時(shí)，齦溝液中HNP1-3的含量水平增加。HNP1-3水平升高與收集部位的齦溝液體積增大無(wú)關(guān)，因?yàn)橹委煏?huì)導(dǎo)致炎癥消退、齦溝液流速降低。

牙周治療后HNP1-3水平的升高可能與齦溝部位的特殊生物學(xué)特性有關(guān)，在健康狀態(tài)下，牙齦結(jié)締組織中不存在炎性細(xì)胞，而齦溝中含有中性粒細(xì)胞，這些中性粒細(xì)胞會(huì)隨著菌群的變化而從組織中遷移，牙周治療后HNP水平升高的另一個(gè)原因是牙周病變的消除。防御素是某些細(xì)菌蛋白酶的底物，牙齦能夠?qū)Σ糠挚咕暮洼^低水平的HNP1-3進(jìn)行蛋白水解分解[17]。另一方面，在本研究表明抗菌肽濃度越高，聚集程度越大，推測(cè)在治療前由于HNP聚集，ELISA法不能有效地測(cè)定高濃度的HNP1-3；另一個(gè)原因可能是抗菌肽與細(xì)菌脂多糖和DNA的結(jié)合，使HNP在樣品初始離心后留在顆粒中。

齦溝液體積增大表明炎癥嚴(yán)重程度增加，牙齦炎的早期癥狀之一是齦溝液流速的增加和出血傾向的增加。本研究中，所有的齦溝液樣本都是在同一時(shí)間段內(nèi)收集的，數(shù)據(jù)以每個(gè)測(cè)量點(diǎn)的總量表示。這是因?yàn)樵谘装Y活躍的情況下，液體體積的增加可能導(dǎo)致研究分子稀釋值(僅局部存在)的錯(cuò)誤讀數(shù)，或當(dāng)其同時(shí)在外周血中表達(dá)時(shí)，其濃度升高[18]。

傳統(tǒng)牙周治療的局限性促使人們尋找新的更好的治療方式。抗菌肽是一種天然免疫成分，它能有效地對(duì)抗牙周病原菌，而不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，可以有效地預(yù)防和治療牙周炎。然而，人們對(duì)其作用的認(rèn)識(shí)仍然非常有限，迄今為止發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種抗菌肽中沒有一種對(duì)牙周治療有臨床意義。本研究選取五種公認(rèn)的牙周可疑致病菌，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法進(jìn)行厭氧菌檢測(cè)，結(jié)果表明牙周基礎(chǔ)治療能夠降低牙周致病菌的檢出率。

綜上所述，本研究中官兵齦溝液中HNP1-3的總量增加，但仍需要進(jìn)一步研究來(lái)充分闡明HNP1-3在牙周病中的作用，為提高部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力、全面提升醫(yī)療保障能力提供重要補(bǔ)充。