王偉，鄭水平，羅琴

作者單位：荊門市中醫(yī)醫(yī)院，a脾胃一科，b肺病科，湖北 荊門 448000

胃癌是消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一，也是我國第二高發(fā)腫瘤［1］，其早期階段臨床表現(xiàn)不明顯，很難早期診斷，導(dǎo)致死亡率升高［2］。目前胃癌診斷主要方法為胃鏡檢查，但此方法花費較大，檢查時病人較為痛苦，因此尋找替代方法十分必要［3］。長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（long noncoding RNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA MALAT1）可通過調(diào)控細胞周期及細胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生［4］。有研究表明，胃癌高危人群血清中胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）水平處于異常狀態(tài)，PG 可作為癌前病變的篩查指標［5-6］。然而目前關(guān)于lncRNA MALAT1、PG 聯(lián)合應(yīng)用于胃癌早期診斷的研究較少。因此，本研究通過探討血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平在早期胃癌中的診斷價值，以期為胃癌早期臨床診斷和及時治療開辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年3 月至2019 年4 月入住荊門市中醫(yī)醫(yī)院的96例胃癌病人（病人經(jīng)胃鏡檢查和病理檢查確診，并進行胃癌切除手術(shù)）為研究對象，最終納入其中TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人67 例（早期胃癌組），男37例，女30例；年齡范圍為44～73歲，年齡（58.64±12.38）歲；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ病人29 例（進展期胃癌組），男16 例，女13 例；年齡范圍為44～76 歲，年齡（58.47±13.26）歲；同期選取82 例健康體檢者作為對照組，男43 例，女39 例；年齡范圍為45～74 歲，年齡（59.73±14.36）歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：①符合2010年衛(wèi)生部發(fā)布且實施的胃癌診斷標準［7］，且經(jīng)胃鏡及病理組織學檢查確診為胃癌者，且病人未進行放化療等治療；②臨床資料記錄清晰者；③對照組無胃十二指腸疾病史；④無其他消化系統(tǒng)疾病者。排除標準：①有肝、腎、心、肺等臟器功能不全疾病及相關(guān)手術(shù)史者；②伴有感染性疾病者；③入院前一個月服用影響血清指標檢測藥物者；④同時參與其他研究者。本研究中所有病人均由兩名及以上主治醫(yī)師明確診斷，所有受試對象均由專業(yè)人員詳細告知本人及近親屬研究內(nèi)容并同意參加，同時簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

檢查各胃癌病人腫瘤分化、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤、血管侵犯、TNM 分期等臨床病理參數(shù)。收集兩組一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、飲酒史、吸煙史。

1.2 主要試劑與儀器 PG I 試劑盒（貨號WL8104A），購自北京利德曼生化股份有限公司；PG Ⅱ試劑盒（貨號WL8104B），購自北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒（貨號R1050），購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；miScript SYBR?Green Mix（貨號218073），購自上海齊一生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix（貨號Q111-02），購自南京諾唯贊生物科技有限公司。ABI 7500實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）儀，購自廣州市百菱生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血樣，3 000 r/min 離心15 min 后收集血清，置于-80 ℃保存待測。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平 采用qRT-PCR 法檢測兩組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 表達水平。采用RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR 儀對lncRNA MALAT1 進行擴增。qRTPCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA（50 μg/L）2 μL，miScript SYBR?Green Mix 10μL，正反向引物（10μmol/L）各0.8μL，ddH2O 6.4μL，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃，30 s；45個循環(huán)。lncRNA MALAT1及內(nèi)參GAPDH 的引物序列見表1。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法對血清lncRNA MALAT1 含量進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 檢測血清中PGⅠ、PGⅡ水平 采用膠乳免疫比濁法檢測血清PG I 和PG Ⅱ水平，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s 表示，兩組間比較行t 檢驗；計數(shù)資料以例表示，兩組間比較行χ2檢驗；采用Pearson 法分析胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 與PGⅠ、PGⅡ水平的相關(guān)性；ROC 診斷是否患胃癌。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較 不同腫瘤分化、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤、血管侵犯的胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，PGⅠ水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

表2 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

注：lncRNA MALAT1為長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1，PGⅠ為胃蛋白酶原Ⅰ，PGⅡ為胃蛋白酶原Ⅱ。

病理參數(shù)腫瘤分化例數(shù)MALAT1t值1.42 P值0.158 PGⅠ/（μg/L）t值1.86 P值0.066 PGⅡ/（μg/L）t值1.86 P值0.067高低31 65 109.73±15.66 115.26±18.73 36.96±7.24 39.81±6.93 11.94±3.97 13.62±4.23腫瘤長徑≤4 cm＞4 cm陽性淋巴結(jié)百分比≤9%＞9%TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ神經(jīng)浸潤0.57 0.573 1.80 0.075 1.96 0.053 24 72 118.73±19.77 121.54±21.46 37.95±7.42 41.37±8.26 12.72±2.38 14.36±3.85 0.83 0.412 1.51 0.134 1.91 0.060 28 68 116.24±18.43 119.75±19.16 46.54±7.23 49.21±8.12 11.97±2.19 13.22±3.17 6.66 0.000 13.93 0.000 25.09 0.000 67 29 103.24±16.85 128.43±17.43 50.46±8.23 31.43±5.01 6.92±1.38 22.53±4.67 1.25 0.214 1.79 0.077 1.93 0.057有無73 23 126.57±18.32 121.21±16.54 46.84±9.73 42.79±8.57 15.34±5.46 12.84±5.27血管侵犯1.61 0.112 1.59 0.115 1.58 0.117有無74 22 119.84±14.56 114.27±13.33 39.84±7.23 36.97±8.12 19.27±6.18 16.89±6.21

2.2 三組一般資料比較 三組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒比例、吸煙比例等比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三組一般資料比較/例

2.3 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較 進展期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于早期胃癌組和對照組，PGⅠ水平顯著低于早期胃癌組和對照組（P＜0.05）；早期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于對照組，PG Ⅰ水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

表4 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

組別對照組早期胃癌組進展期胃癌組F值P值例數(shù)82 67 29 lncRNA MALAT1 86.25±19.58 103.24±16.85 128.43±17.43 59.44＜0.001 PGⅠ/（μg/L）64.78±12.94 50.46±8.23 31.43±5.01 117.42＜0.001 PGⅡ/（μg/L）3.88±0.68 6.92±1.38 22.53±4.67 858.48＜0.001

2.4 胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 與PGⅠ、PG Ⅱ水平的相關(guān)性 胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平與PGⅡ呈正相關(guān)，與PGⅠ呈負相關(guān)（r=-0.58、0.70，均P＜0.05）。

2.5 血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平對早期胃癌的診斷價值 以lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ單個指標及三者聯(lián)合預(yù)測值為檢驗變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，lncRNA MALAT1 診斷早期胃癌病人的AUC 為0.77［95%CI（0.70，0.84）］，截斷值為103.03，此時的特異度為89.0%，靈敏度為63.5%；PG Ⅰ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.85［95%CI（0.79，0.91）］，截斷值為52.63 μg/L，此時的特異度為80.5%，靈敏度為75.0%；PGⅡ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.81［95%CI（0.75，0.87）］，截斷值為20.36 μg/L，此時的特異度為65.9%，靈敏度為83.3%；lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合診斷早期胃癌病人的AUC 為0.89［95%CI（0.84，0.94）］，特異度為81.3%，靈敏度為85.4%。

3 討論

胃癌因早期臨床癥狀不明顯經(jīng)常導(dǎo)致錯失最佳治療時機，且影響胃癌預(yù)后，使得胃癌死亡率成為各種惡性腫瘤第3 位，對人類健康和生命的危害較大［8］。目前胃癌大多依靠于胃鏡檢查，不僅費用昂貴，且對操作人員的技術(shù)要求較高，有時難以早期確診，大多數(shù)病人確診時已處于中晚期［9］。目前臨床上用于早期胃癌檢測的其他生物標志物靈敏度和特異度不高，因此，尋找新的、可靠的早期胃癌診斷生物標志物已成為目前的研究熱點。

LncRNA 是一類非編碼RNA 的總稱，其長度大于200 核苷酸，LncRNA 雖不編碼蛋白質(zhì)，但在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中能發(fā)揮調(diào)控作用［10］。LncRNA MALAT1 最初在非小細胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物進化中高度保守，參與許多腫瘤的發(fā)生［11］。lncRNA MALAT1 在多種腫瘤中呈高表達，如肺癌、宮頸癌、乳腺癌等，具有促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用［12-13］。PG 分為PGⅠ和PGⅡ兩種同工酶原，是由胃黏膜分泌的胃蛋白酶前體物質(zhì)，能夠反映胃黏膜狀態(tài)的變化。PGⅠ、PGⅡ主要由胃主細胞、頸黏液細胞以及少量組織腺體合成，是參與消化的一種蛋白酶前體物質(zhì)。PG合成后僅有少量經(jīng)胃黏膜進入血液循環(huán)，因此檢測血清PG水平的變化可判斷胃黏膜狀態(tài)［14］。劉永等［15］通過檢測、對比、分析胃癌病人和健康者血清中癌胚抗原、糖類抗原724、lncRNA MALAT1 水平，將三者聯(lián)合用于胃癌檢測，證明其可用于胃癌發(fā)病風險的預(yù)測且具有診斷價值。本研究結(jié)果表明不同腫瘤分化、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤、血管侵犯等胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較，均差異無統(tǒng)計學意義；進展期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于早期胃癌組和對照組，PGⅠ水平顯著低于早期胃癌組和對照組，早期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平高于對照組，PGⅠ水平顯著低于對照組。提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ與早期、進展期胃癌病情均密切相關(guān)，對胃癌檢出有重要提示作用，且在胃癌臨床分期中有一定的應(yīng)用價值，推測PGⅠ、PGⅡ可能通過影響胃黏膜損害而影響胃癌的進展。本研究中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ?qū)ρ芮址浮⑸窠?jīng)浸潤等臨床病理特征的判斷價值不高。

本研究一般資料中，對照組、早期胃癌組、進展期胃癌組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒比例、吸煙比例等比較，均差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性，對實驗研究結(jié)果不產(chǎn)生影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平與PGⅡ呈正相關(guān)，與PGⅠ呈負相關(guān)。進一步提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ可能通過差異表達參與胃癌病情發(fā)展。lncRNA MALAT1 診斷早期胃癌病人的AUC 為0.77，截斷值為103.03，此時的特異度為89.0%，靈敏度為63.5%；PGⅠ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.85，截斷值為52.63μg/L，此時的特異度為80.5%，靈敏度為75.0%；PGⅡ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.81，截斷值為20.36μg/L，此時的特異度為65.9%，靈敏度為83.3%。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ?qū)υ缙谖赴┒加幸欢ǖ脑\斷價值，且ROC曲線中PGⅠ的曲線下面積相較于其他兩個更大，診斷價值相對更高。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合診斷早期胃癌病人的AUC 為0.89，特異度為81.3%，靈敏度為85.4%。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合檢測時，早期胃癌診斷的AUC、靈敏度均顯著提高。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合檢測優(yōu)于各指標單獨檢測，提高lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ單獨使用時的靈敏度，能提高其對早期胃癌的診斷價值。

綜上所述，lncRNA MALAT1聯(lián)合PGⅠ、PGⅡ可在一定程度上檢出胃癌，為早期胃癌臨床診斷及治療提供理論依據(jù)及新思路，對降低胃癌發(fā)病率及死亡率有重要意義。提示在臨床中需密切監(jiān)測lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平的變化，以提高胃癌早期診斷。但本研究為回顧性研究，有部分遺失病例，資料完整性限制了研究，且樣本數(shù)量較少、因素分析可能不夠全面，需加大樣本量進行深入的臨床應(yīng)用研究。