王萬虹，史波，張榮林，丁浩，李錦爽，李志龍，葉力碩

作者單位：1南京鼓樓醫(yī)院集團宿遷醫(yī)院、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800；

2宿遷市中醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800；

3江西財經(jīng)大學(xué)統(tǒng)計學(xué)院，江西 南昌 333000

冠心病仍然是心血管疾病中對人類健康危害最大的疾病，也是心血管疾病中發(fā)生猝死最常見的疾?。?-2］。既往文獻報道信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子4（transcriptional activator 4，STAT4）在多種器官組織中表達，尤其在淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中較高表達［3-5］。STAT4 在Th1/Th2 淋巴細胞分化中作用重大，尤在Th1 中較顯著［6］。STAT4可以通過抑制Eoxp3+的調(diào)節(jié)性T 細胞反應(yīng)，促進自身免疫疾病的發(fā)生［7］。文獻報道STAT4基因敲除小鼠除了白細胞介素12（IL-12）反應(yīng)受損外，還有更多T 輔助淋巴細胞向Th2 分化［8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)螺旋B表面肽（helix B surface peptide，HBSP）可使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平降低、M1 型巨噬細胞的數(shù)量減少、M1/M2 型巨噬細胞比例降低、抑制內(nèi)皮細胞凋亡以及促進巨噬細胞向M2型極化，從而抑制AS。HBSP 或可作為干預(yù)冠狀動脈病變的新靶點；更有研究指出冠心病病人心外膜脂肪組織巨噬細胞浸潤較非冠心病病人更明顯，表明冠心病的嚴重程度與M1/M2 型巨噬細胞成正比［10］。本研究自2020 年3—10 月探討STAT4 信號通路在脂肪酶（LPS）/Toll樣受體4（TLR4）調(diào)控M1/M2 型巨噬細胞分化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型和STAT4-KO 小鼠共40 只，4～8 周齡，體質(zhì)量為19～22 g，由南京大學(xué)模式動物中心引進。小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF 級屏障系統(tǒng)動物房，按照SPF 級飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基（美國，Hy-Clone）、ELISA、Q-RTPCR 試劑盒（Abcam 公司）、HERAcell VISO160i 型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）、兔抗小鼠F4/80，iNOS，F(xiàn)TLR4，CD40，CD14，CD11b，Arg-1和CD206多克隆抗體（BD公司，美國）；電泳儀、圖像采集和圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）等。

1.3 方法

1.3.1 建立動脈內(nèi)膜拉傷-增生模型 將野生型和STAT4-KO 小鼠用導(dǎo)絲拉傷頸動脈內(nèi)膜，建立內(nèi)皮損傷-修復(fù)模型。以超聲心動圖及病理改變作為建模成功的觀察指標。分為野生型和STAT4-KO組。

1.3.2 流式細胞術(shù)分析M1/M2 型巨噬細胞在外周血和損傷血管內(nèi)的變化 取各組小鼠外周血0.5 mL 于流式上樣管，按F4/80，iNOS，F(xiàn)TLR4，CD40，CD14，Arg-1 和CD206 抗體說明書，根據(jù)抗體組合方案，每管分別加5μL 抗體，避光孵育20 min；71.6×g離心5 min，棄上清，PBS 清洗，54.8×g 離心5 min，收集沉淀加500μL PBS 重懸，300 目篩子過濾，30 min內(nèi)上機檢測，Cell Quest軟件進行細胞分類分析。

1.3.3 免疫熒光雙染檢測M1，M2 型巨噬細胞的表達 14 d 后將大鼠處死，制備肝組織石蠟切片。取兩組的大鼠肝組織石蠟切片進行組織免疫熒光染色，CD163 抗體（1∶100）標記M1、M2 型巨噬細胞（紅色），6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標記細胞核（藍色），分別于波長559 nm 和340 nm 激發(fā)光熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，Adobe Photoshop 軟件合成圖片，用Image J 軟件計算鏡下5 個視野（×200倍）內(nèi)CD163+標記M1、M2 型巨噬細胞的陽性表達率。

1.3.4 實時熒光定量PCR（q-RT PCR）檢測STAT4和TLR4的表達 用q-RT PCR法檢測各組STAT4和TLR4 的表達變化，RNA 的提取、逆轉(zhuǎn)錄以及q-RT PCR 都按照試劑盒的說明書操作進行。β-actin 作為STAT4 和TLR4 的內(nèi)參，通過2-ΔΔCt公式分析得到其表達情況。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血管生長因子VEGF、PDGF-BB 變化 選取相應(yīng)處理后的細胞培養(yǎng)上清用于VEGF、PDGF-BB 的ELISA 檢測，向相應(yīng)的樣品孔中加入與其對應(yīng)的樣品，37 ℃放置90 min；向每個孔中加入100μL 生物素化的抗體工作液，于37 ℃下放置1 h；每個孔中加100μL酶結(jié)合工作液，37 ℃放置30 min ；每個孔中加90 μL 底物溶液（TMB），37 ℃下避光放置15 min 左右；往每個孔中加50 μL 終止液；測量各孔的光密度（OD）值。建立標準曲線，然后進行計算。

1.3.6 巨噬細胞的分化情況 從STAT4KO 和WT小鼠骨髓分離CD11b+細胞，用集落刺激因子GMCSF 和脂肪酶（lipase，LPS）處理，分為WT con 組、WT+LPS 刺激組、STAT4KO con 組、STAT4KO+LPS刺激組。ELISA 法檢測M2 型巨噬細胞的誘導(dǎo)因子（IL-4）及M2型巨噬細胞分泌因子（IL-10）的mRNA表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 選用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)資料以±s 表示。細胞分類分析采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，兩組均值比較采用t 檢驗，多組均值比較采用單因素方差分析，定性資料用百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 M1/M2 型巨噬細胞在外周血內(nèi)的變化 與野生組相比，STAT4-KO 組在術(shù)后1、4、7 和14 d 時M1型巨噬細胞F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+IL-12 的細胞百分比降低（P＜0.05），而M2型巨噬細胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比明顯升高（P＜0.05）。且M1型巨噬細胞F4/80+iNOS+及M2 型巨噬細胞F4/80+Arg-1+組別和時間的交互作用對細胞百分比的影響均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.62、8.06，P＜0.05）。其中M1型巨噬細胞F4/80+iNOS+在第1、4、7、14天野生組和STAT4-KO 組細胞百分比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.90、77.29、68.29、54.00，P＜0.05），M2 型巨噬細胞F4/80+Arg-1+在第1、4、14 天野生組和STAT4-KO 組細胞百分比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=522.98、74.99、26.85，P＜0.05）。M1 型巨噬細胞F4/80+F4/80+IL-12 組別和時間對細胞百分比的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.20、483.66，P＜0.05），其中時間具有主效應(yīng)，第1、4、7、14天細胞百分比兩兩比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。M2 型巨噬細胞F4/80+CD206+組別和時間對細胞百分比的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=242.15、139.54，P＜0.05），其中時間具有主效應(yīng)，第1、4、7、14天細胞百分比兩兩比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2，3。

表2 不同時間外周血M1型巨噬細胞F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+IL-12的細胞百分比/（%，±s）

表2 不同時間外周血M1型巨噬細胞F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+IL-12的細胞百分比/（%，±s）

組別野生組STAT4-KO組F值P值重復(fù)次數(shù)iNOS 1 d 3.60±0.51 2.04±0.85 18.62＜0.001 4 d 11.09±1.04 5.89±1.13 7 d 17.88±1.81 7.39±1.63 14 d 31.49±2.80 18.56±2.20 33 IL-12 1 d 5.55±0.47 4.32±0.51 2.80 0.076 4 d 10.95±1.38 8.77±0.93 7 d 16.33±1.76 13.14±1.37 14 d 22.52±1.84 18.03±1.68

表3 不同時間外周血M2型巨噬細胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比/（%，±s）

表3 不同時間外周血M2型巨噬細胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比/（%，±s）

組別野生組STAT4-KO組F值P值重復(fù)次數(shù)Arg-1 1 d 7.54±0.77 12.03±0.84 8.06 0.002 4 d 8.47±1.13 13.40±1.00 7 d 10.32±1.39 18.02±1.59 14 d 20.51±2.09 25.00±2.50 33 CD206 1 d 6.80±0.55 10.29±0.76 0.10 0.957 4 d 8.40±0.74 12.25±0.92 7 d 10.80±1.24 14.84±1.40 14 d 14.17±1.58 18.21±1.60

2.2 免疫熒光雙染檢測M1、M2 型巨噬細胞的表達 STAT4-KO組的M1、M2型巨噬細胞陽性表達率與野生組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 M1、M2型巨噬細胞的陽性表達率比較/（%，±s）

表4 M1、M2型巨噬細胞的陽性表達率比較/（%，±s）

組別野生組STAT4-KO組t值P值重復(fù)次數(shù)33 M1巨噬細胞11.14±1.49 9.42±0.41 4.98＜0.001 M2巨噬細胞48.73±5.89 89.48±10.43 15.22＜0.001

2.3 STAT4 和TLR4 的表達情況 STAT4 和TLR4在STAT4-KO 組中的表達量明顯較野生組低（P＜0.05），見表5。

表5 信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子4（STAT4）、Toll樣受體4（TLR4）的表達情況比較/±s

表5 信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子4（STAT4）、Toll樣受體4（TLR4）的表達情況比較/±s

組別野生組STAT4-KO組t值P值重復(fù)次數(shù)33 TLR4 0.89±0.08 0.47±0.06 18.46＜0.001 STAT4 1.31±0.07 0.23±0.04 58.00＜0.001

2.4 血管生長因子VEGF、血小板衍生因子PDGFBB 的變化情況 血管生長因子VEGF、血小板衍生因子PDGF-BB在STAT4-KO組中的表達量明顯較野生組高（P＜0.05），見表6。

表6 血管生長因子VEGF、PDGF-BB的變化情況/±s

表6 血管生長因子VEGF、PDGF-BB的變化情況/±s

組別野生組STAT4-KO組t值P值重復(fù)次數(shù)33 VEGF 3.14±0.91 9.28±1.02 20.09＜0.001 PDGF-BB 4.23±0.84 10.56±1.62 15.54＜0.001

2.5 巨噬細胞的分化情況 M2 型巨噬細胞的誘導(dǎo)因子（IL-4）及分泌因子（IL-10）在STAT4KO+LPS刺激組、WT+LPS 刺激組、STAT4KO con 組中的表達量明顯較WT con 組高（P＜0.05），其中STAT4KO+LPS刺激組表達量最為顯著。見表7。

表7 巨噬細胞的分化情況/±s

表7 巨噬細胞的分化情況/±s

組別WT con組WT+LPS刺激組STAT4KO con組STAT4KO+LPS刺激組F值P值重復(fù)次數(shù)3333白細胞介素-4 0.49±0.06 1.02±0.21 2.11±0.37 4.02±1.01 80.68＜0.001白細胞介素-10 0.98±0.14 1.22±0.36 2.91±0.42 5.29±1.31 77.04＜0.001

3 討論

大數(shù)據(jù)顯示，目前心血管疾病死亡率占居民疾病死亡率40%，遠高于腫瘤和其他疾病，因此在中國開展心肌保護和心肌再生醫(yī)學(xué)研究是非常有必要的。炎癥免疫反應(yīng)是一種損傷過程，近來免疫系統(tǒng)在血管再生中發(fā)揮的作用越來越得到重視。參與固有免疫應(yīng)答的細胞主要包括巨噬細胞、NK 細胞、NK1.1+T細胞、樹突狀細胞和B-1細胞等［11-12］。微生物可以通過Toll樣受體介導(dǎo)的信號通路在固有免疫應(yīng)答中引起非T 細胞依賴的IL-12 分泌［13］。巨噬細胞根據(jù)其表面標識、屬性和功能的不同，可分為經(jīng)典激活巨噬細胞（Ⅰ型，M1）和替代激活巨噬細胞（Ⅱ型，M2）。研究發(fā)現(xiàn)M1 型巨噬細胞通過γ-干擾素和細菌脂多糖（LPS）激活，可釋放大量的炎性因子IL-1、IL-6 等，促進炎癥反應(yīng)，促進心肌細胞的損傷和動脈粥樣硬化（AS）病變的發(fā)展［14-15］；M2型巨噬細胞由IL-4、IL-13 和免疫復(fù)合物激活，表達IL-10等，起著抗炎的作用，促進血管新生、組織修復(fù)［16-17］。M1/M2 型巨噬細胞可以參與炎癥反應(yīng)、促進組織修復(fù)，并且與一些干細胞或者擁有祖細胞性質(zhì)的一些細胞產(chǎn)生一定程度的交互作用，可能在組織修復(fù)和重構(gòu)的過程中扮演著重要角色［18］。

本研究中，我們對STAT4信號通路在LPS/TLR4調(diào)控M1/M2 型巨噬細胞分化的作用及機制進行研究，發(fā)現(xiàn)與野生組對比，在STAT4 基因缺失組中術(shù)后1、3、7 和14 天時M1 型巨噬細胞F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+IL-12 的細胞百分比降低，而M2 型巨噬細胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比明顯升高。說明STAT4 信號通路在M1、M2 巨噬細胞的分化過程中起著重要作用?？梢蕴嵘奘杉毎鸄rg-1 的表達水平，抑制iNOS的表達，促進巨噬細胞的M2型極化發(fā)展。STAT4-KO 組的M1 巨噬細胞陽性表達率為（9.42±0.41）%，野生組為（11.14±1.49）%，STAT4-KO 組的M2 巨噬細胞陽性表達率為（89.48±10.43）%，野生組為（48.73±5.89）%，即表示抑制STAT 信號通路后，M1 型巨噬細胞得到抑制，而M2型巨噬細胞分化得到明顯增強。有研究指出，INF-γ引起的M1 型巨噬細胞極化主要是介導(dǎo)了酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）的通路，通過激活JAK1 和JAK1 激酶后使轉(zhuǎn)錄因子STAT1發(fā)生磷酸化，從而引起M1 型標志分子的轉(zhuǎn)錄表達，IL-12 通過刺激JAK2 和酪氨酸激酶2 活性，使STAT4 的磷酸化后參與M1 型巨噬細胞的極化［19］。STAT4 和TLR4 在STAT4-KO 組中的表達量明顯較野生組低，血管生長因子VEGF、PDGF-BB 在STAT4-KO 組中的表達量明顯較野生組高，說明在STAT4 基因的缺失可以明顯促進VEGF、PDGF-BB因子的釋放。對于細胞實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細胞的誘導(dǎo)因子（IL-4）及分泌因子（IL-10）在STAT4KO+LPS 刺激組、WT+LPS 刺激組、STAT4KO con 組中的表達量明顯較WT con 組高，其中STAT4KO+LPS 刺激組表達量最為顯著。即說明STAT4 信號通路也參加巨噬細胞的增殖與分化過程，在STAT4基因的缺失和LPS的刺激下M2型巨噬細胞的分化程度得到明顯增強。有研究還發(fā)現(xiàn)，STAT4 基因缺失可顯著促使巨噬細胞的M2 型極化［20］，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，STAT4信號通路可以抑制M1型巨噬細胞，從而促進增強M2 型巨噬細胞分化，其作用機制可能是通過LPS/TLR4 的結(jié)合。本研究可以為心梗病人介入治療后防止再狹窄和血栓提供新的思路和一定的基礎(chǔ)支持。可進一步研究STAT4 信號通路及巨噬細胞變化與內(nèi)皮細胞和血管新生的關(guān)系。