趙潔婷，李會(huì)方，葉偉，宋蓉蓉，徐建平

作者單位：安徽省胸科醫(yī)院病理科，安徽 合肥 230022

結(jié)核分枝桿菌最常見的感染部位是肺，但也可影響其他部位，如淋巴結(jié)、骨骼和關(guān)節(jié)、泌尿生殖道和胸膜等，這類病例可被診斷為肺外結(jié)核（extrapulmonary TB，EPTB）［1］。與肺結(jié)核相比，人們對(duì)肺外結(jié)核關(guān)注不足，其相關(guān)研究也相對(duì)較少。由于肺外結(jié)核的臨床表現(xiàn)形式多樣，臨床上肺外結(jié)核病的診斷比較困難，時(shí)常被誤診或漏診。肺外結(jié)核病是一種可治性疾病，早期診斷和治療對(duì)改善其預(yù)后意義重大［2］。本研究對(duì)80 例肺外結(jié)核病人的臨床病理資料進(jìn)行分析，探究其臨床病理特征及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查在疾病確診過程中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年8 月至2019 年8 月間就診于安徽省胸科醫(yī)院并經(jīng)組織病理學(xué)診斷的80例肺外結(jié)核病人的臨床病理資料，男性41 例，女性39 例。年齡范圍為19～84 歲，年齡（47.91±16.78）歲，中位年齡49歲。

1.2 病理診斷 內(nèi)鏡、穿刺活檢或手術(shù)切除組織，常規(guī)行10%的中性福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片及HE 染色。由三名高年資病理醫(yī)生雙盲法閱片，按照《中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)》［3］推薦的結(jié)核病診斷流程，結(jié)合形態(tài)學(xué)改變、特殊染色及分子病理基因檢測(cè)作出診斷。

1.3 福爾馬林固定-石蠟包埋（FFPE）標(biāo)本熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)MTB-DNA 石蠟包埋組織厚5μm連續(xù)切片，活檢標(biāo)本10 片，手術(shù)標(biāo)本5 片，置于1.5 mL EP管中，嚴(yán)格按廈門艾德公司核酸提取試劑（閩夏械備20150082號(hào)）說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取。使用紫外分光光度計(jì)對(duì)核酸濃度和純度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)核酸合格的樣品嚴(yán)格按結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）說(shuō)明書進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌DNA 的測(cè)定。結(jié)果分析：目標(biāo)基因的CT 參考值為39，內(nèi)標(biāo)的CT 參考值為40。對(duì)于測(cè)定CT≤39 的樣本，報(bào)告為結(jié)核分枝桿菌DNA 陽(yáng)性；對(duì)于測(cè)定CT＞39 的樣本，同時(shí)內(nèi)標(biāo)CT≤40，報(bào)告注明結(jié)核分枝桿菌DNA 低于試劑盒檢測(cè)下限，若內(nèi)標(biāo)CT＞40 或無(wú)顯示，該檢測(cè)無(wú)效。結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購(gòu)自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司。

1.4 FFPE 標(biāo)本抗酸染色 采用Ziehl-Neelsen 染色法，抗酸染色試劑（粵珠械備20170035號(hào)）購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。石蠟包埋組織4μm 連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，將切片周圍余液吸干。后續(xù)具體操作流程按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，常規(guī)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 FFPE標(biāo)本分枝桿菌菌種鑒定 對(duì)已提取的待測(cè)樣品DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、雜交、洗膜和顯色等步驟進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。具體操作嚴(yán)格按分支桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法）說(shuō)明書（注冊(cè)號(hào)：國(guó)械注標(biāo)20153400229）進(jìn)行。試劑盒購(gòu)自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s 表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將熒光PCR 組作為共用對(duì)照，其余各實(shí)驗(yàn)組均與熒光PCR 組比較，而各實(shí)驗(yàn)組間不須比較，采用χ2分割法，α'=α/2（k-1），α=0.05，k 為實(shí)驗(yàn)組數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 80 例肺外結(jié)核中，年齡分布19～84 歲，年齡（47.91±16.78）歲，其中19～30 歲16 例（20.0%），31～40 歲12 例（15.0%），41～50 歲16 例（20.0%），51～60 歲15 例（18.8%），61～70 歲12 例（15.0%），71～84歲9例（11.2%）。

2.2 合并癥 分析80 例肺外結(jié)核病人的臨床資料發(fā)現(xiàn)，有合并癥者8 例（10.0%），其中合并糖尿病的1例，癌癥3例，腎移植1例，高血壓2例，腎功能不全1 例。合并肺結(jié)核的有45 例（56.3%），除30 例（66.7%）在就診前已明確有肺結(jié)核，其余15 例（33.3%）均是在肺外結(jié)核的診療過程中確診。

2.3 肺外結(jié)核的組成及臨床表現(xiàn) 肺外結(jié)核可發(fā)生于全身多器官、組織，以淋巴結(jié)結(jié)核多見。多數(shù)病人的首發(fā)癥狀以系統(tǒng)局部癥狀為主，結(jié)核全身中毒癥狀少見。肺外結(jié)核的部位及臨床表現(xiàn)見表1。

表1 肺外結(jié)核80例組成及臨床表現(xiàn)

2.4 肺外結(jié)核的病理特征 肺外結(jié)核的病理變化與肺結(jié)核一致，基本病理變化主要為滲出性、增生性（包括壞死性肉芽腫和非壞死性肉芽腫）和壞死性病變，這3種病理變化?；祀s存在，往往以某一種改變?yōu)橹?，并且隨著機(jī)體抵抗力、對(duì)MTB 變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度、MTB 菌量及毒力強(qiáng)度的不同而相互轉(zhuǎn)化。在本研究中，淋巴結(jié)結(jié)核病理改變以壞死性肉芽腫常見（72.7%）；鼻、咽、喉、聲帶、聲門結(jié)核病理改變以滲出性病變常見（54.6%）；骨、關(guān)節(jié)結(jié)核病理改變以壞死性肉芽腫常見（44.4%）；泌尿、生殖系統(tǒng)結(jié)核病理改變以壞死性肉芽腫常見（50.0%），消化道結(jié)核病理改變以壞死性肉芽腫常見（50.0%），腹膜結(jié)核及皮膚結(jié)核病理改變均以壞死性肉芽腫常見（100%）。不同部位的結(jié)核，其病理改變見表2。

表2 肺外結(jié)核80例的病理改變/例（%）

2.5 常見結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)比較 回顧性分析病人的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，對(duì)不同結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性率進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 檢測(cè)的陽(yáng)性率高于菌種鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTC（χ2=19.88，P＜0.001）、高于血液檢測(cè)結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)TSPOT（χ2=16.65，P＜0.001）和血清學(xué)結(jié)核抗體檢測(cè)（χ2=47.21，P＜0.001），F(xiàn)FPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 的陽(yáng)性率與抗酸染色陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.74，P=0.017）。見表3。

表3 肺外結(jié)核80例相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查

肺外結(jié)核占全部結(jié)核病的比例約10%～20%［4］。肺外結(jié)核病死亡人數(shù)占結(jié)核病全部死亡人數(shù)的9.8%［5］。之前的一些研究已經(jīng)證實(shí)了肺外結(jié)核患病與年齡相關(guān)，主要原因是年齡越大抵抗力越差，患病的風(fēng)險(xiǎn)越高［6-9］。本研究未見小于19歲的青少年發(fā)病，真正原因尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為可能原因?yàn)椋涸谥袊?guó)，為預(yù)防兒童結(jié)核病普遍進(jìn)行新生兒卡介苗接種，從而限制了結(jié)核桿菌在體內(nèi)的傳播［10］。然而，這種干預(yù)并不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫［11］。同時(shí)，我們的研究提示，患病人群主要集中在20～60 歲，這可能與機(jī)體的免疫動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，也可能還涉及生活習(xí)慣和社會(huì)因素［12］。無(wú)論如何，我們的發(fā)現(xiàn)對(duì)于實(shí)現(xiàn)不同年齡病人的肺外結(jié)核的預(yù)防和控制有著重要的意義，提醒醫(yī)生要警惕肺外結(jié)核的發(fā)生，以防止漏診或延誤診斷。

已知的研究結(jié)果顯示，結(jié)核病的危險(xiǎn)因素（糖尿病、免疫抑制劑的使用、肺癌、營(yíng)養(yǎng)不良等）在肺結(jié)核和肺外結(jié)核中均可見［13-14］。本研究結(jié)果顯示，在80 肺外結(jié)核中，伴有糖尿病的1 例、癌癥3 例、長(zhǎng)期服用免疫抑制藥物的1 例、高血壓2 例，腎功能不全者1 例，此結(jié)果提示肺外結(jié)核在免疫功能正常的人群中的發(fā)生情況不容小覷。有些未得到控制的肺結(jié)核，結(jié)核分枝桿菌入血，通過血行播散至其他臟器，導(dǎo)致肺外結(jié)核。肺外結(jié)核也可引起繼發(fā)性肺結(jié)核［15］。本研究發(fā)現(xiàn)80 肺外結(jié)核病人中，45 例（56.3%）伴有肺結(jié)核。除30例在就診前已明確有肺結(jié)核，其余15 例均是在肺外結(jié)核的診療過程中確診。

肺外結(jié)核可影響多器官或組織，其中以淋巴結(jié)和胸膜最為常見。淋巴結(jié)結(jié)核約占肺外結(jié)核的30%～50%，最常見的部位是頸部、下頜下或鎖骨下的淋巴結(jié)，胸內(nèi)和腹腔內(nèi)淋巴結(jié)感染較少［16］。在本研究中，淋巴結(jié)結(jié)核的發(fā)生率約為55%。此結(jié)果和王謙信、陳水芳［17］的研究結(jié)果相符。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，鼻、咽、喉、聲帶、聲門是繼淋巴結(jié)之后，肺外結(jié)核較常感染的部位（13.8%），然而，一項(xiàng)有關(guān)中國(guó)肺外結(jié)核多中心觀察性研究提示，鼻、咽、喉、聲帶、聲門結(jié)核的比例僅1.1%［1］。我們發(fā)現(xiàn)骨、關(guān)節(jié)是肺外結(jié)核的比例約11.2%，該比例略高于上述中國(guó)肺外結(jié)核多中心觀察性研究的結(jié)果6.4%［1］。泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核在我們的研究中也有出現(xiàn)，比例約10%，其在上述多中心觀察性研究結(jié)果的比例為2.1%［1］。這些差異表明，肺外結(jié)核流行病學(xué)的動(dòng)態(tài)可能與地理位置和人口有關(guān)，需要在不同的地理區(qū)域進(jìn)行更多以人口為基礎(chǔ)的研究。本研究結(jié)果顯示消化道結(jié)核的比例為5.0%，腹膜結(jié)核及皮膚結(jié)核的比例均為2.5%，該結(jié)果與上述多中心研究的結(jié)果基本一致（消化道結(jié)核4.8%，腹膜結(jié)核及皮膚結(jié)核均為2.2%）。

因肺外結(jié)核可累及多系統(tǒng)、多部位、多臟器，這就決定了其臨床表現(xiàn)的多樣性、非特異性及隱匿性［18-19］。部分病人病程中可無(wú)發(fā)熱和其他結(jié)核中毒癥狀，多以局部表現(xiàn)為主，如局部淋巴結(jié)的腫大或膿腫的形成。鼻、咽、喉、聲帶、聲門部位的結(jié)核癥狀以局部表現(xiàn)為主，如異物感、聲音嘶啞等。骨、關(guān)節(jié)結(jié)核癥狀主要為病變部位的疼痛或壓痛。泌尿、生殖系統(tǒng)結(jié)核在我們的研究中也有出現(xiàn)，病人就診的主要原因?yàn)榫植康陌鼔K，檢查提示盆腔、鞘膜腔少量積液等。消化道及腹膜結(jié)核往往表現(xiàn)為腹脹、腹痛、腹瀉、惡心嘔吐乏力，盆、腹腔積液等。皮膚結(jié)核主要表現(xiàn)為局部包塊。尤其在疾病早期，肺外結(jié)核可與多種疾病的表現(xiàn)相類，僅憑體檢和無(wú)創(chuàng)性檢查無(wú)法診斷，極易造成誤診或漏診，需憑借手術(shù)或穿刺等有創(chuàng)手段獲取組織標(biāo)本，參考病理組織學(xué)改變做出診斷。

肺外結(jié)核的病理變化與肺結(jié)核一致，均包括滲出性、增生性和壞死性三種病變［3］。滲出性病理改變主要為局部組織小血管擴(kuò)張、充血，伴中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見炎性滲出及纖維素樣壞死。增生性病變以壞死性肉芽腫和非壞死性肉芽腫多見。當(dāng)菌量多、毒力強(qiáng)、機(jī)體抵抗力低下或變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)烈時(shí)滲出性和增生性病變可出現(xiàn)以壞死為主的病理變化［3］。在本研究中，淋巴結(jié)結(jié)核的主要病理改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[（72.7%），其次為壞死性病變（19.2%），少數(shù)表現(xiàn)為非壞死性肉芽腫（9.1%）。鼻、咽、喉、聲帶、聲門結(jié)核的主要病理改變?yōu)闈B出性病變（54.6%），其次為壞死性肉芽腫（36.4%），少數(shù)表現(xiàn)為壞死性病變（9.1%）。骨、關(guān)節(jié)結(jié)核主要病理改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[（44.4%），其次為壞死性病變（27.3%）和滲出性病變（22.3%）。泌尿、生殖系統(tǒng)結(jié)核主要病理改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[（50.0%），其次為非壞死性肉芽腫（25.0%）和壞死性病變（25.0%）。腹膜結(jié)核及皮膚結(jié)核的病理改變均表現(xiàn)為壞死性肉芽腫（100%）。結(jié)果提示結(jié)核分枝桿菌感染不同部位時(shí)，其主要病理改變存在差異。然而，無(wú)論哪一部位的肺外結(jié)核，基本都有肉芽腫病變，在影像上肉芽腫可有不同的表現(xiàn)，有些與腫瘤性疾病相似，特別是正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET-CT）上，肉芽腫性病變呈高攝取，標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUV）類似惡性腫瘤，需要與腫瘤性疾病鑒別［20］。當(dāng)然，仍需進(jìn)一步的研究，以探究機(jī)體發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)的免疫反應(yīng)與感染部位的關(guān)系。

需要注意的是，結(jié)核病的大體觀察、組織學(xué)表現(xiàn)及細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)雖然具有一定的特異性，但所有上述表現(xiàn)亦可出現(xiàn)在其他感染性和非感染性肉芽腫性病變中。所以常規(guī)的病理學(xué)診斷手段并非結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，必須通過其他輔助檢查找到結(jié)核病病原學(xué)依據(jù)方可確診［3］。本研究對(duì)FFPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR、抗酸染色、分枝桿菌菌種鑒定、血液T-SPOT及血清學(xué)結(jié)核抗體在肺外結(jié)核檢測(cè)中的陽(yáng)性率進(jìn)行了比較。與既往的相關(guān)報(bào)道相同［21］，F(xiàn)FPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 檢測(cè)的陽(yáng)性率（91.3%）明顯高于抗酸染色（77.5%）。眾所周知，抗酸染色靈敏度低、特異性差，需10 000個(gè)/毫升的菌量方能獲得陽(yáng)性結(jié)果，且結(jié)果受判讀者的主觀因素影響較大，易造成漏診或誤診［22］。熒光PCR 技術(shù)是針對(duì)MTB 的核酸進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度可提高至10 個(gè)/毫升MTB，且試劑盒設(shè)計(jì)時(shí)選擇相對(duì)保守的病原體核酸片段，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增與熒光信號(hào)收集，特異性強(qiáng)且重復(fù)性好［21］。且在臨床診療過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 陽(yáng)性比僅抗酸染色單陽(yáng)更有助于結(jié)核病的診斷。分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)，該方法設(shè)計(jì)針對(duì)特定同源基因或序列（16rDNA）的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的探針，并將探針標(biāo)記在固相的基質(zhì)上（纖維素膜），通過探針與待測(cè)序列的結(jié)合情況間接判斷DNA 序列的組成，從而達(dá)到鑒別菌種的目的［23］。結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)與上述結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 均屬于分子診斷技術(shù)，然而結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定MTC 的陽(yáng)性率（61.3%）明顯低于后者（91.3%）。具體原因，仍需進(jìn)一步探究。FFPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 的陽(yáng)性率也明顯高于血液T-SPOT（62.5%）和血清學(xué)結(jié)核抗體（34.6%）。有研究表明病人年齡、性別等一般資料及免疫抑制狀態(tài)、惡性腫瘤等基礎(chǔ)疾病對(duì)血TSPOT 試驗(yàn)結(jié)果和血清學(xué)結(jié)核抗體結(jié)果均產(chǎn)生一定的影響，故其在診斷結(jié)核病方面存在一定局限性［24］。由此可見，F(xiàn)FPE標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR技術(shù)在檢測(cè)EPTB 結(jié)核分枝桿菌中有顯著優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)EPTB早期診斷有較高的價(jià)值。

綜上所述，肺外結(jié)核臨床特征缺乏特異性，全身多器官、組織均可發(fā)生，臨床表現(xiàn)以系統(tǒng)局部癥狀為主，全身中毒癥狀少見。組織學(xué)病理改變結(jié)合FFPE 標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌熒光PCR 檢測(cè)對(duì)提高肺外結(jié)核的診斷效率有重要價(jià)值。