廖文筠，張瑩瑩，陳睦虎，劉英，劉濟滔，陽鳳，彭林，尹德鋒，鐘武

作者單位：西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，a急診醫(yī)學(xué)部，b老年醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000

由各種因素所致感染的膿毒血癥休克死亡率在致死性疾病榜單中排前10 位［1-2］。目前對膿毒癥休克病人進行補液復(fù)蘇治療，盡管血容量已經(jīng)補足，甚至使用血管活性藥物后病人仍然普遍出現(xiàn)無法解釋的持續(xù)性動脈低血壓［3-4］。因此，本實驗大膽地假設(shè)頑固性動脈低血壓發(fā)生機制可能與動脈中膜平滑肌細胞（SMC）表型轉(zhuǎn)變相關(guān)，即在國內(nèi)外首次提出膿毒癥可致血管中膜平滑肌細胞表型改變的假設(shè)，并通過實驗進行理論驗證。輔酶Q10 是細胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細胞代謝啟動劑，具有保護和恢復(fù)生物膜結(jié)構(gòu)的完整性、清除自由基功能，預(yù)防血管壁脂質(zhì)過氧化等能力，已被大量研究證明具有改善線粒體氧化呼吸鏈功能障礙的功效［6-8］。脂多糖（LPS）導(dǎo)致膿毒血癥休克可明顯刺激SD大鼠血管平滑肌細胞產(chǎn)生過多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，從而導(dǎo)致血管病理化發(fā)展。頑固性休克的病理生理特征是血管對兒茶酚胺刺激的反應(yīng)受損和病理性血管舒張不受控制。收縮型平滑肌細胞是正常情況下血管壁的重要組成部分，而疾病病理血管則表現(xiàn)為合成型，本研究自2020 年2—8 月研究輔酶Q10 對膿毒血癥中大鼠血管平滑肌細胞功能的影響，為膿毒血癥休克的病理性血管形成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 40 只健康成年SD 大鼠，雄性，平均4 月齡，體質(zhì)量（200±10）g（西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供）；DMEM／F12 培養(yǎng)基，特級胎牛血清，胰蛋白酶，青霉素，鏈霉素（美國GIBCO 公司）；平滑肌肌動蛋白（α-actin）抗體，骨橋蛋白（OPN）抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗、二抗及蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）試劑盒（Sigma 公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物制劑研究所）；膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）檢測試劑盒（美國GLPBIO公司）。

1.2 膿毒癥休克動物模型建立、VSMC 的分離、培養(yǎng)及鑒定 采用SD 大鼠尾靜脈注射LPS 5.0 mg/kg的方法建立膿毒癥休克動物模型，造模后觀察大鼠的一般情況：主要包括大鼠的外觀形態(tài)，精神狀態(tài)，活動情況，有無出血，口唇和掌趾顏色及溫度。造模成功的標準為：最初表現(xiàn)有豎毛，蜷縮及弓背，大鼠活動量和靈活性下降，走路無力，并發(fā)現(xiàn)大鼠寒戰(zhàn)，精神倦怠，乏力的表現(xiàn)，逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，呼吸急促和口唇發(fā)紺，給予刺激時躲閃遲鈍或無躲閃動作，較少有進食水者；后續(xù)觀察到大鼠逐漸出現(xiàn)內(nèi)眥和口鼻處出血伴有深慢呼吸表現(xiàn)，掌趾顏色蒼白及觸摸時發(fā)涼，給予刺激時無任何反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)有昏迷狀態(tài)。有休克表現(xiàn)后（統(tǒng)一12 h 后），脊椎脫臼法處死，固定于動物解剖臺，迅速分離取出主動脈，采用0.2%膠原酶消化分離平滑肌細胞，自然純化及差速貼壁純化血管平滑肌細胞，DMEM 培養(yǎng)基及10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)細胞。取第4 代細胞進行免疫熒光鑒定。收集第4～6代的細胞，裂解并提取總蛋白，Western blotting 檢測平滑肌特異性的α-actin和OPN的表達情況。

1.3 CCK-8 檢測各實驗組VSMC 增殖 將兩組SMC 消化，調(diào)整細胞密度為2×108/L，接種到2 個96孔板中，每個孔板設(shè)置4個時間點，每個時間點設(shè)置5 個復(fù)孔，每孔加入100 μL 細胞懸液。在培養(yǎng)6、12、24、48 h 后，分別在每組每個時間點加入10 μL的細胞計數(shù)試劑盒8（cell counter kit-8，CCK-8）試劑，然后在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后用酶標儀檢測吸光度（absorbance，A）值，檢測波長為450 nm。

1.4 檢測各實驗組VSMC 的丙二醛MDA 濃度將兩組SMC 分別培養(yǎng)6、12、24、48 h，從6 孔板中消化，調(diào)整細胞密度為2×108/L 后制作細胞勻漿，按MDA 試劑盒說明書操作，在532 nm 處測各管吸光度值。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組VSMC 中α-actin和OPN 的表達水平 將分離后的SMC 分別接種到96 孔板中，將實驗分為四組，分別為：正常對照組、正常對照組+輔酶Q10、LPS 組、LPS+輔酶Q10 組，細胞培養(yǎng)48 h 后，收集SMC，提取總蛋白，離心去除細胞碎片后收集上清，用BCA 法測定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度，以2 g/L 的濃度進行電泳，結(jié)束后將蛋白進行轉(zhuǎn)膜。在37 ℃下用封閉液封閉膜2 h，加入一抗兔抗鼠α-actin，4 ℃搖床過夜，PBST 洗膜3次。將膜用顯影液顯影3 min，蒸餾水沖洗終止顯色。其他種類蛋白檢測操作步驟一致。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以±s 表示計量資料，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)及免疫熒光鑒定 取長勢良好的第4代細胞進行α-actin 免疫熒光染色，鏡下可見細胞質(zhì)內(nèi)大量綠色陽性染色（×400）。見圖1。

2.2 Western blotting 檢測平滑肌肌動蛋白的表達 取第4～6代的正常對照組細胞，進行裂解并提取總蛋白，Western blotting 檢測P4、P5、P6 組平滑肌細胞α-SM-actin 的相對表達量分別為1.75±0.02、1.74±0.03、1.76±0.01，結(jié)果顯示VSMC特異性的肌動蛋白（α-SM-actin）均呈陽性表達，α-SM-actin 的相對表達量計算公式：α-SM-actin 的表達量/GAPDH 的表達量，且各組間比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.65，P=0.537）。

2.3 CCK-8 檢測各實驗組SMCs 增殖 正常對照組SMCs 在6、12、24、48 h 的OD 值呈逐漸增加趨勢，LPS 組SMCs 的OD 隨時間變化而逐漸降低；正常對照組的OD值明顯高于LPS組（P＜0.01）。見表1。

表1 CCK-8檢測兩組SMCs增殖情況/±s

表1 CCK-8檢測兩組SMCs增殖情況/±s

組別正常對照組LPS組t值P值重復(fù)次數(shù)55 6 h 0.74±0.03 0.46±0.03 25.86＜0.001 12 h 0.93±0.02 0.35±0.01 60.03＜0.001 24 h 1.52±0.16 0.28±0.03 36.22＜0.001 48 h 2.35±0.20 0.19±0.03 32.71＜0.001

2.4 檢測各實驗組SMCs的MDA濃度

2.4.1 正常對照組與LPS 組SMCs 的MDA 濃度 正常對照組SMCs的MDA值隨著時間增加并沒有明顯的改變，但是LPS 組MDA 值隨著時間變化而逐漸增高，并且明顯高于正常對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組SMCs的MDA濃度變化/（μmol/L，±s）

表2 兩組SMCs的MDA濃度變化/（μmol/L，±s）

組別正常對照組LPS組t值P值重復(fù)次數(shù)55 6 h 0.68±0.02 1.17±0.20 7.00＜0.001 12 h 0.71±0.03 3.53±0.16 65.61＜0.001 24 h 0.70±0.02 4.12±0.18 72.83＜0.001 48 h 0.69±0.01 4.58±0.16 82.19＜0.001

2.4.2 輔酶Q10 干預(yù)下SMCs 的MDA 含量 正常對照組與正常對照組+輔酶Q10 在6、12、24、48 h 四個時間點的MDA 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；LPS+輔酶Q10 組在四個時間點的MDA 值均較LPS組明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組SMCs的MDA濃度變化/（μmol/L，±s）

表3 各組SMCs的MDA濃度變化/（μmol/L，±s）

注：①與正常對照組比較，P＞0.05。②與LPS組比較，P＜0.01。

組別正常對照組正常對照組+輔酶Q10 LPS LPS組+輔酶Q10組F值P值48 h 1.06±0.10 1.05±0.06①4.62±0.13 2.20±0.18②232.87＜0.001重復(fù)次數(shù)5555 6 h 0.72±0.01 0.72±0.02①1.26±0.15 0.84±0.01②52.35＜0.001 12 h 0.86±0.01 0.84±0.02①3.23±0.11 1.51±0.02②17.86＜0.001 24 h 0.88±0.02 0.90±0.01①3.58±0.12 1.97±0.09②791.55＜0.001

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組VSMC 中α-肌動蛋白α-SM-actin、骨橋蛋白OPN 的表達水平 正常對照組與正常對照組+輔酶Q10 在48 h 時間點的兩個蛋白的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而在LPS+輔酶Q10 組中α-肌動蛋白在48 h 時間點的相對表達量較LPS 組上調(diào)了1.57 倍（P＜0.05）；骨橋蛋白OPN 的相對表達量下調(diào)了1.17 倍（P＜0.05），蛋白相對表達量計算公式：該蛋白的表達量/GAPDH的表達量。見表4，圖2。

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組VSMC中α-肌動蛋白α-SM-actin、骨橋蛋白OPN的表達水平

表4 各組平滑肌細胞α-SM-actin和OPN的相對表達量/±s

表4 各組平滑肌細胞α-SM-actin和OPN的相對表達量/±s

組別正常對照組正常對照組+輔酶Q10 t值P值LPS組LPS+輔酶Q10組t值P值重復(fù)次數(shù)3333 α-SM-actin 1.50±0.02 1.50±0.03 0.48 0.644 0.83±0.03 1.30±0.02 35.43＜0.001 OPN 0.76±0.06 0.75±0.01 0.25 0.809 1.54±0.04 1.32±0.05 9.59＜0.001

3 討論

目前嚴重感染及其相關(guān)的感染性休克和多器官功能障礙綜合征是臨床上病死率居高不下的重要因素，特別高發(fā)于普外科急診手術(shù)及ICU 病人［5］。膿毒癥休克死亡率在致死性疾病榜單中排前10位。輔酶Q10 是細胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細胞代謝啟動劑，具有保護和恢復(fù)生物膜結(jié)構(gòu)的完整性、清除自由基功能，預(yù)防血管壁脂質(zhì)過氧化等能力，已被大量研究證明具有改善線粒體氧化呼吸鏈功能障礙的功效［6-8］。通過大量文獻驗證，輔酶Q10在濃度為50μmol/L時，對細胞培育時的抗氧化功效最強，故后續(xù)實驗采用此濃度［9-10］。

LPS 可明顯刺激SD 大鼠血管平滑肌細胞產(chǎn)生過多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA，因而測試MDA 的量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。發(fā)生機制可能是LPS影響線粒體電子傳遞鏈，導(dǎo)致其內(nèi)部電子發(fā)生“逃逸”，生成大量的活性氧類（ROS）。超出機體清除范圍的活性氧類可使脂質(zhì)過氧化，最終形成MDA，其在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性。 輔酶Q10是電子傳遞鏈的重要輔助因子，存在于多數(shù)真核細胞中，尤其是線粒體，參與電子傳遞鏈活動。因此，輔酶Q10 可通過提高線粒體電子傳遞鏈功能，減少電子“逃逸”而減輕氧化應(yīng)激損傷。

在實驗中采用正常對照組對比LPS 組，正常對照組對比正常對照組+輔酶Q10，LPS+輔酶Q10 組對比LPS 組，檢測在6、12、24、48 h 四個時間點的MDA 水平，觀察VSMC 氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成情況。正常對照組和正常對照組+輔酶Q10 之間無明顯差異；而正常對照組和LPS 組，LPS+輔酶Q10 組和LPS組，均存在明顯差異，每個時間點LPS 組VSMC 產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物明顯高于正常對照組，而每個時間點LPS+輔酶Q10組VSMC產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物明顯少于LPS 組。上述結(jié)果表明，內(nèi)毒素可明顯刺激SD 大鼠血管平滑肌細胞產(chǎn)生過多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，輔酶Q10 可以明顯緩解LPS 帶來的VSMC 氧化應(yīng)激損傷。CCK-8檢測各實驗組SMCs增殖情況，我們發(fā)現(xiàn)LPS 組的OD 值明顯低于正常對照組，證實LPS 可顯著抑制平滑肌細胞增殖。這可能導(dǎo)致膿毒血癥休克病人血管壁中膜平滑肌細胞數(shù)量減少，從而影響血管壁彈性回縮力。

目前對膿毒癥休克病人進行液體復(fù)蘇治療，盡管血容量已經(jīng)補足，甚至使用血管活性藥物后病人仍然普遍出現(xiàn)無法解釋的持續(xù)性動脈低血壓。眾所周知動脈血壓的產(chǎn)生是由于血管腔內(nèi)容量負荷和血管壁中膜平滑肌層彈性回縮力的共同效應(yīng)，通過大量研究證實了有兩種功能明顯不同的VSMC：一種功能表現(xiàn)為收縮型，分化完全，含有較多的肌絲，是正常情況下血管壁的重要組成部分；另一種在胚胎發(fā)育中期和疾病病理血管中，功能表現(xiàn)為合成型，含肌絲極少，具有合成和分泌包括膠原蛋白、彈力蛋白等的功能［11-12］。大量具有VSMC 選擇性和特異性的基因被確定用于標記分化成熟的收縮型VSMC，例如血管平滑肌α-肌動蛋白（smooth muscle α-actin，α-SM-actin），而至今尚未發(fā)現(xiàn)能特異性代表合成型細胞的基因，而是通過綜合收縮型特征蛋白的表達以及與合成表型功能相關(guān)蛋白的增減情況來判定，例如指示合成型蛋白：黏附性糖蛋白—骨橋蛋白（OPN）［13-15］。正常狀態(tài)下VSMC 胞質(zhì)中α-SM-actin 含量占比高，表現(xiàn)為收縮型，是正常情況下血管壁的重要組成部分［16］。我們實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h 后，正常對照組+輔酶Q10 和正常對照組比較α-SM-actin、骨橋蛋白OPN 的表達量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LPS 組中α-SM-actin 表達量比正常對照組顯著降低，LPS 組中OPN 表達量比正常對照組顯著提高。證明了膿毒血癥頑固性動脈低血壓的機制可能為動脈中膜平滑肌細胞受到損傷后其收縮能力急劇降低所致，其原因可能是平滑肌細胞在內(nèi)毒素刺激下表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停フＱ苤心?yīng)有的收縮能力。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組VSMC在48 h時間點的α-肌動蛋白α-SM-actin、骨橋蛋白OPN 的表達水平，顯示輔酶Q10 對正常的VSMC 的α-SM-actin 表達無明顯影響，而可顯著提高因內(nèi)毒素刺激的VSMC 中α-SMactin 蛋白表達水平。證明了輔酶Q10 可部分逆轉(zhuǎn)平滑肌細胞因內(nèi)毒素刺激而發(fā)生的表型轉(zhuǎn)變。

綜上所述，頑固性休克為伴有終末器官功能障礙的低血壓，常需大劑量升壓藥維持，病死率高達60%。頑固性休克的病理生理特征是血管對兒茶酚胺刺激的反應(yīng)受損和病理性血管舒張不受控制。收縮型平滑肌細胞是正常情況下血管壁的重要組成部分，而疾病病理血管則表現(xiàn)為合成型，輔酶Q10降低了因LPS 導(dǎo)致膿毒血癥休克所致的VSMC 氧化應(yīng)激損傷，而大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物可能推動了血管病理性轉(zhuǎn)化。本文為膿毒血癥休克的病理性血管形成提供理論基礎(chǔ)，輔酶Q10 可明顯減低氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成及上調(diào)α-actin 蛋白的相對表達量，緩解了因LPS 導(dǎo)致膿毒血癥休克所致的血管病理化轉(zhuǎn)變。后續(xù)仍需進行動物實驗及臨床試驗進一步驗證。

（本文圖1見插圖8-1）