崔賀

上海市政工程設計研究總院(集團)有限公司

隨著我國農村生活水平提高和經濟發(fā)展，農村生活污水產生量逐年增加，對農村水環(huán)境安全造成威脅[1-5]。盡管農村生活污水處理設施已在多數農村地區(qū)得以廣泛應用，但由于農村生活污水排放具有流量小、時變化系數大等特點，加之污水處理設施管理和運行不當，設施尾水普遍存在氨氮（NH4+-N）、硝氮（NO3--N）及總氮（TN）超標等問題，極易導致當地水體污染，甚至引發(fā)黑臭現象[6-8]。農村水環(huán)境問題已成為當前亟須解決的熱點環(huán)境問題之一[9-10]。

農村生活污水處理設施尾水氮素超標的主要原因可歸結為以下幾類[11-14]：1）好氧段硝化不足；2）排泥及污泥回流設施癱瘓；3）碳源不足導致反硝化效率低下。農村生活污水處理設施因其工藝和運行的差異，一般會產生低氨氮高硝氮型、氨氮和硝氮等比例型和高氨氮低硝氮型3種不同氮素賦存形態(tài)比例的尾水。為實現尾水達標排放，采用曝氣浮床濕地對尾水進行深度凈化，已成為當前生活污水末端治理的重要方式[11,14]。然而，在尾水深度凈化過程中如何提高反硝化效率，實現硝氮的強化去除，依然是一個難點問題[15-17]。

管式反應器呈管狀，具有高長徑比，管內流體以推流狀態(tài)前進，且在流動方向無返混現象，即管內沿程每一點的流體停留時間均相等[18-20]。此外，管式反應器還具有“三傳一反”和“濃度遞變”的特征，即管內同時發(fā)生質量傳遞、動量傳遞、熱量傳遞和化學反應4個過程，流體中的反應物濃度沿程遞變[21-22]。因此，將管式反應器與曝氣浮床濕地進行耦合集成，構建管式生物反應裝置（tubular bio-reactor device，TBD）[23]，有助于在管內形成好氧-缺氧環(huán)境，從而實現相關污染物的強化脫除。

筆者通過構建中試規(guī)模的TBD，考察其對不同氮素賦存形態(tài)的農村生活污水的脫氮性能，并采用微生物高通量技術解析管內相關微生物分布特征，以期為削減農村生活污水處理設施尾水的氮排放負荷以及促進農村地區(qū)水環(huán)境質量改善提供新型水處理技術的參考。

1 材料與方法

1.1 中試規(guī)模TBD的構建及運行

1.1.1 裝置構建

在上海某高校內的一個圓形水池中構建TBD中試試驗裝置（圖1）。水池直徑為7.1 m，深度為1.2 m，容積約50 m3。中試裝置以中空的聚氯乙烯（PVC）管為浮體，浮體上方放置10根并聯的TBD，其進口均與集水槽出水口連接（圖2）。集水槽用于儲存農村生活污水處理設施尾水，該尾水通過動力循環(huán)設備（射流曝氣機或水泵）提升。

圖1 TBD中試裝置照片Fig.1 Photo of pilot-scale TBD

圖2 TBD中試裝置構造Fig.2 Structure of pilot-scale TBD

10根TBD均由PE軟管（長12 m，直徑10 cm，厚度0.3 mm，長徑比120）和填充基質（填充率為33%）制成?；|填充方式為棕絲包裹甘蔗渣，棕絲蓬松多孔且具有一定剛度的結構，能夠較好地分散并固定甘蔗渣，避免甘蔗渣因水流作用而堵塞堆積。此外，填充基質中的甘蔗渣填充率為8%，TBD沿程不開孔，在TBD管外種植3種常見水生植物（香菇草、黑麥草和水葫蘆）。

1.1.2 運行條件

2016年5—7月試運行3個月后正式開始中試試驗，依次在3種工況（表1）下運行，每個工況下運行150 d。TBD的進水流量通過集水槽中的水位高度調節(jié)，運行時集水槽中的水位高出TBD所在平面1.0 ～ 1.3 m，從而為TBD的進水提供相應壓頭。運行中每根TBD的平均水流流速為1.5 m/h，平均循環(huán)流量為 5.5 L/h，平均水力停留時間為4.75 d。

表1 TBD中試裝置不同工況下的供試水質及運行條件Table 1 Water quality and operation conditions of pilot-scale TBD in different operating modes

1.2 樣品采集及檢測方法

1.2.1 水樣采集及常規(guī)水質指標的檢測方法

在TBD中試裝置運行期間，每15 d對試驗供試尾水進行采樣和檢測，采樣點為水池中心的1個點及靠近水池周邊呈等邊三角形分布的3個點，取上述4個采樣點的混合樣，作為TBD對氮去除性能分析的依據。為測試TBD沿程水質分布，在每根TBD進口處（記作0處）、距進口1/4處、距進口1/2處、距進口3/4處、出口處（記作1處）分別進行水樣采集，并取10根TBD相應點位的混合樣，作為TBD氮形態(tài)沿程分布特征，以及影響TBD脫氮性能的理化因素分析依據。

采用溶解氧儀（HACH-HQ30D型）在上述點位原位測量溶解氧（DO）濃度和水溫，采用 pH計（HANNA-HI98129型）測量pH。根據《水和廢水監(jiān)測分析方法》中標準方法測定化學需氧量（CODCr）及TN、NH4+-N和NO3--N濃度等指標。

1.2.2 生物膜樣品采集及16S rRNA多樣性高通量測序方法

2017年11月，在TBD中間（1/2處）及末端采集填充基質（編號分別為Z1和Z2），放入自封袋并立即帶回實驗室；快速用無菌水振蕩處理樣本，基質表面附著物脫落后離心分離固體，通過冷鏈送至生工生物工程（上海）股份有限公司提取DNA和測序。提取DNA后，對16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)片段進行PCR擴增，引物序列為515F（GTGCCAGCM GCCGCGGTAA）和909R（CCCCGYCAATTCMTTTR AGT），獲取原始序列和數據。繼而利用Mothur對原始序列進行校正，去除序列中的嵌合體，得到優(yōu)化序列；使用 UPARSE 軟件[3]（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。進一步利用RDP classifier軟件[5](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數據庫（v138），設置比對閾值為70%。最后計算樣品文庫覆蓋率（Coverage）、Chao 1指數及Shannon多樣性指數，并在屬水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成[24-25]。

2 結果與討論

2.1 氮的去除性能分析

2.1.1 NH4+-N

中試TBD在不同工況條件下對NH4+-N的去除性能如圖3(a)所示。3種工況條件下NH4+-N的去除率具有顯著差異性（P＜0.05），且工況3的NH4+-N去除效果最佳。在工況1條件下，運行30 d時水池中NH4+-N濃度從8.81 mg/L降至1.58 mg/L；運行45 d時，NH4+-N的去除率高達93.34%，此后氨氮的去除率保持平穩(wěn)狀態(tài)；運行150 d時，NH4+-N去除率達94.54%，此時NH4+-N濃度為0.48 mg/L，低于Ⅱ類水質標準限值（NH4+-N濃度≤0.5 mg/L）。在工況2條件下，初始NH4+-N濃度較低，運行30 d時水池中NH4+-N濃度即從1.60 mg/L降至1.25 mg/L；運行60 d時，NH4+-N濃度降至 0.18 mg/L，去除率為88.78%，此后TBD對NH4+-N的去除率保持平穩(wěn)狀態(tài)；運行150 d時，NH4+-N去除率達 89.65%，NH4+-N濃度為 0.16 mg/L，接近Ⅰ類水質標準（NH4+-N濃度≤0.15 mg/L）。在工況3條件下，僅運行15 d，水池中NH4+-N濃度即從12.01 mg/L降至2.73 mg/L，NH4+-N去除率達77%；運行30 d時，NH4+-N濃度降至0.39 mg/L，去除率達 96%；運行150 d時，NH4+-N濃度降至 0.11 mg/L，低于Ⅰ類水質標準限值。

圖3 TBD中試裝置在3種工況下對NH4+ -N、NO3- -N和TN的去除性能Fig.3 Removal efficiency of NH4+ -N, NO3- -N and TN in pilotscale TBD with three operating conditions

2.1.2 NO3--N

中試TBD在不同工況條件下對NO3--N的去除性能如圖3（b）所示。3種工況條件下NO3--N的去除率具有顯著差異性（P＜0.05）。工況1和工況3在0～15 d時NO3--N濃度均呈上升趨勢，運行初期NO3--N濃度升高的原因可能是NH4+-N迅速硝化產生大量的NO3--N。在工況1條件下，運行30 d時NO3--N濃度降至2.88 mg/L，去除率為70.07%；運行60d時NO3--N濃度降至0.26 mg/L，去除率為97.27%；此后TBD對NO3--N的去除率趨于穩(wěn)定。在工況2條件下，運行30 d時NO3--N濃度降至3.23 mg/L，并在第45天達到穩(wěn)定；運行150 d時NO3--N濃度為1.09 mg/L，去除率達90.97%。在工況3條件下，運行45 d時NO3--N濃度降至0.64 mg/L，此時去除率為90.36%；運行150 d時NO3--N去除率穩(wěn)定至99.61%，此時NO3--N濃度為0.03 mg/L。

2.1.3 TN

中試TBD在不同工況條件下對TN的去除性能如圖3（c）所示。TN濃度在0～45 d顯著下降，之后平緩下降。3種工況條件下，TN的去除率具有顯著差異性（P＜0.05）。在工況1條件下，運行45 d時TN濃度降至2.02 mg/L，去除率為89.91%；運行150 d時TN濃度降至0.951 mg/L（去除率為95.24%），低于Ⅲ類水質標準限值（TN濃度≤1.0 mg/L）。工況2和工況3條件下的 TN去除趨勢與工況1一致，運行150 d時TN去除率分別為89.10%和99.05%，TN濃度分別降至1.64和0.19 mg/L，其中工況3符合Ⅰ類水質標準（TN濃度≤0.2 mg/L）?？傮w而言，TBD對污水中TN的去除率顯著高于Gao等[25]的研究結果（67.7%～84.4%），表明TBD對農村生活污水處理設施尾水具有良好的脫氮性能。

2.2 氮形態(tài)沿程分布特征

圖4展示了3種工況條件下中試TBD氮濃度沿程變化趨勢。工況1和工況2條件下NH4+-N濃度快速下降主要發(fā)生在TBD前半段（進口處至管長1/2處），其原因可能是TBD前端的DO濃度較高，保證了良好的好氧環(huán)境，有利于NH4+-N的轉化。TBD后半段（1/2處至出口處）NH4+-N濃度趨于穩(wěn)定，其原因主要是該區(qū)段較低的DO濃度抑制了硝化作用。

圖4 TBD沿程氮濃度分布Fig.4 Variation of nitrogen concentrations along the TBD

NO3--N濃度的變化趨勢相對復雜，其在各工況運行的TBD前端（進口處至管長1/4處）均出現了上升，在TBD后半段則明顯下降。主要原因是TBD前端較高的DO濃度有利于硝化作用（NH4+-N轉化為NO3--N），導致NO3--N濃度上升；而TBD后半段管內環(huán)境能夠滿足好氧反硝化作用和缺氧反硝化的進行，有利于NO3--N的去除。TBD沿程TN濃度在前端的下降幅度相對較小，主要在TBD后半段發(fā)生了明顯的下降。這是由于TBD前端的硝化作用僅將NH4+-N轉化為NO3--N，并未將氮素從水中脫除[26]；而在TBD后半段，微生物的反硝化作用可將NO3--N轉化為N2，從而實現污水中氮素的脫除[27]。由此可見，TBD中的反硝化作用是實現尾水氮素去除的關鍵步驟。

2.3 影響TBD脫氮性能的理化因素分析

2.3.1 DO濃度

TBD中試裝置在各工況條件下DO濃度沿程變化規(guī)律見圖5（a）。可見DO濃度隨TBD沿程遞減，主要原因是微生物的代謝作用消耗了管內水流中的DO。各工況進水DO濃度差異顯著，但TBD末端DO濃度均低于0.5 mg/L，這是由于緩釋碳源的加入增強了DO的消耗，有助于末端缺氧環(huán)境的形成。TBD中前端DO濃度相對較高，中末端DO濃度則較低，形成了好氧-缺氧（O-A）環(huán)境分段，有助于氮的脫除。此外，進水DO濃度較高的工況3的氮去除效果最優(yōu)，表明高濃度DO進水有利于污水中氮的去除[28]。在TBD中試系統(tǒng)中，NH4+-N的去除速率比NO3--N高，表明該系統(tǒng)的硝化過程比反硝化過程更為快速。而且，TBD的進水DO濃度越高，越有助于NH4+-N的去除。這一結論在TBD進水DO濃度較高的工況1和工況3中得以體現：在2種工況開始運行后30 d內，NH4+-N濃度均降至1.5 mg/L以下，低于Ⅴ類水質標準限值（NH4+-N濃度≤2.0 mg/L）。

2.3.2 C/N

TBD中試裝置在各工況條件下碳氮比（C/N）分布見圖5（a）?？梢奀/N隨 TBD 沿程遞增，主要原因一是甘蔗渣在微生物的分解作用下不斷向水中釋放碳源，二是反硝化作用使得TBD中氮素濃度不斷降低。本研究中C/N較高（＞6），能滿足反硝化對碳源的需求，表明緩釋碳源的加入有助于C/N的提升和保持。一般而言，好氧反硝化作用適宜的C/N必須大于10，而缺氧反硝化作用的C/N≥6即可保證其順利進行[29-30]，這是由于好氧反硝化細菌在進行好氧反硝化作用的同時，也會進行有氧呼吸及有機質降解，故好氧反硝化作用比缺氧反硝化作用需要更充足的C/N[31-32]。這也同時解釋了為何TBD沿程C/N隨著甘蔗渣的釋碳作用而不斷上升，DO濃度則隨著微生物的呼吸和代謝作用逐漸被消耗，從而有利于TBD末端缺氧環(huán)境的形成。

圖5 3種工況下TBD沿程DO濃度、C/N及運行期間CODCr變化Fig.5 Variation of DO and C/N ratio along the TBD as well as CODCr during the operation period under three operating conditions

2.3.3 碳源

圖5（b）展示了3個工況條件下CODCr及增長率隨時間的變化規(guī)律。各工況條件下受試水體的CODCr在TBD作用下均呈先升后降趨勢。TBD系統(tǒng)使用甘蔗渣作為固相緩釋碳源，為TBD內微生物的反硝化作用提供了充足的有機質[33]。各工況在0～15 d內CODCr上升，這是由于TBD中填充的甘蔗渣因微生物分解或表面殘留的可溶性有機物向水體溶出所致。各工況運行15 d后，CODCr逐漸下降，這是由于TBD體系對有機物的去除速率開始高于碳源的釋放速率。其中，工況2在該階段CODCr下降速率最快，其原因可能是工況2處理的農村生活污水處理設施尾水以NO3--N為主要賦存形態(tài)，TBD系統(tǒng)主要進行的是反硝化作用。微生物的異養(yǎng)反硝化作用利用并消耗大量的碳源[34-36]，這導致工況2的CODCr顯著下降。此外，各工況CODCr均未超過Ⅴ類水質標準限值（CODCr≤40.0 mg/L），表明TBD能夠維持水中有機質濃度的穩(wěn)定，不會產生碳源過剩的問題。

2.4 TBD沿程微生物分布特征

2.4.1 多樣性指數分析

為了揭示TBD的微生物脫氮機理，對采集的生物膜樣品進行了16S rRNA高通量測序。消除無效序列和嵌合序列后，2個生物膜樣品共獲得153 357個高質量序列，當序列以97%相似性劃分時，共獲得12 013個OTU單元（OTUs）。樣本庫的覆蓋率為95.3%～97.7%，表明該測序可以代表微生物群落的真實情況。表2中微生物豐富度和多樣性相關指標存在明顯差異，說明 TBD中間和末端的填充基質上微生物的豐富度和多樣性差異較大，這也表明TBD中間和末端的環(huán)境差異較大，從而導致了微生物群落結構的沿程差異。

表2 TBD生物膜樣品的微生物豐度占比和多樣性指數Table 2 Microbial richness and diversity index of the biofilm samples from the TBD

2.4.2 優(yōu)勢菌群豐度占比分析

TBD中試裝置生物膜樣品中門水平和屬水平微生物優(yōu)勢群落組成如圖6所示。由圖6(a)可知，TBD中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）占比較大。樣品Z1、Z2中Proteobacteria的豐度占比較高，分別為73.5%和77.4%；其次是Bacteroidetes，占比分別為8.6%和5.3%；Planctomycetes的占比分別為3.6%和3.0%。

Proteobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes包含典型的氮素去除微生物，這在不同的廢水處理過程中均有發(fā)現[37-38]。Proteobacteria在天然和人工濕地中普遍存在，并含有參與碳、氮循環(huán)的大量細菌[39-40]。Bacteroidetes被證明與富含纖維素的有機廢物如植物殘留物和農業(yè)廢物以及污泥的降解有關[41-42]。Planctomycetes則被認為是最多樣化的菌門分支。

由圖6（b）可知，中試TBD后半段的優(yōu)勢菌屬差異較大（P＜0.05）。TBD長度1/2處的優(yōu)勢菌屬主要是檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）和綠膿桿菌屬（Pseudomonas），它們均被報道具有好氧反硝化功能[43]。TBD末端的優(yōu)勢菌屬主要是熱單胞菌屬（Thermomonas）、小梨形菌屬（Pirellula）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和黃色類固醇桿菌（Steroidobacter）。相關研究表明，Thermomonas和Steroidobacter可進行缺氧反硝化作用[44]，TBD中充足的 C/N（10 ～ 15）及較適宜的DO濃度（1.5 ～ 3.5 mg/L）有利于上述菌屬的生長富集。而Pirellula和Chryseobacterium被報道可分解大分子有機物[45]。大分子有機物的降解需要充足的時間，造成其在TBD末端富集。由此可見，TBD沿程富含碳源且好氧-缺氧分段的環(huán)境因子分布特征促進了好氧反硝化細菌和缺氧反硝化細菌在其沿程上的依次分布。

圖6 TBD生物膜樣品在門水平及屬水平的豐度占比Fig.6 Abundance of biofilm samples of the TBD at the phylum and genus level

2.4.3 脫氮相關菌屬分析

表3展示了中試TBD運行末期的反硝化相關菌屬豐度占比，主要包括好氧反硝化菌屬和缺氧反硝化菌屬，表中所列菌屬均被報道過具有好氧反硝化或缺氧反硝化功能。由表3可知，Z1中好氧反硝化菌屬較多，如Citrobacter、Acinetobacter、Rhizobium和Pseudomonas，其豐度占比合計為40.5%，表明TBD系統(tǒng)較高的進水DO濃度有利于好氧反硝化菌屬的富集和生長。值得注意的是，Z1中也發(fā)現了2.0%的缺氧反硝化相關菌屬，其原因可能是TBD中間填充基質的生物膜中形成了好氧-缺氧的微環(huán)境。Z2以缺氧反硝化細菌為主（19.0%），如Thermomonas、Steroidobacter和Hyphomicrobium，其豐度占比明顯高于Z1，這可能與TBD末端較低的DO濃度有關。由此推斷，TBD末端的缺氧環(huán)境能夠促進缺氧反硝化菌屬的生長和富集。較低的DO濃度不利于好氧菌的富集[41]，這也解釋了為何TBD末端的好氧反硝化菌屬豐度占比較低。有研究表明，好氧反硝化細菌在缺氧環(huán)境下也能夠進行反硝化作用，但其生長速率明顯低于好氧環(huán)境[46-47]。而缺氧反硝化細菌更適宜在DO濃度較低的環(huán)境中生長[48]，這也解釋了為何缺氧反硝化菌在TBD末端成為主要優(yōu)勢菌屬，且豐度占比達19%。Z1和Z2在上述2類菌屬豐度占比上的顯著差別，與2.3節(jié)所述的TBD沿程DO濃度分布具有明顯相關性，且與TBD沿程不同形態(tài)氮的去除規(guī)律一致：TBD前端NH4+-N的削減較明顯，后端NO3--N的削減較顯著。綜上，TBD好氧反硝化-缺氧反硝化的分段式菌屬分布特征可能是其具有較高氮素去除性能的主要原因。

表3 TBD生物膜樣品中的脫氮相關菌屬的豐度占比Table 3 Abundance of nitrogen removal functional genera in the biofilm samples from the TBD%

3 結論

（1）在中試TBD中以不同DO濃度的進水條件處理不同氮素賦存形態(tài)污水，各工況條件下NH4+-N、NO3--N和TN的去除率均高于90%，表明TBD具有良好的脫氮性能。

（2）中試 TBD運行中，出水 CODCr始終低于GB 3838—2002的V類標準限值，表明TBD不會產生碳源過量的二次污染問題。此外，通過分析各工況條件下TBD的沿程環(huán)境因子及氮素形態(tài)轉化特征可知，DO濃度沿程遞減，C/N沿程遞增，形成了TBD特有的沿程好氧-缺氧分段生境。

（3）高通量測序結果表明，TBD中段以好氧反硝化細菌（占比40.5%）為主，末端則以缺氧反硝化細菌（19.0%）為主，由此形成了好氧反硝化-缺氧反硝化菌屬沿程依次分布特征，并推測該特征是TBD具有較高脫氮性能的主要原因，這對農村生活污水處理設施尾水的強化脫氮技術創(chuàng)新具有一定參考價值。