周思蕾，孫冠群*，曾榃倫，程卓，梁喜俊

0 引言

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第六大常見癌癥，也是死亡率排名前三的癌癥[1]。中國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌相關(guān)死亡人數(shù)的51%。盡管治療干預(yù)（如射頻消融、肝切除、肝移植及全身放療）進(jìn)展迅速，但由于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，肝癌患者的預(yù)后并不理想。此外，由于早期癥狀的非特異性及敏感生物診斷標(biāo)志物的缺乏，大多數(shù)病例最初即被診斷為肝癌晚期。因此，揭示新的診斷和預(yù)后分子生物標(biāo)志物對開發(fā)有效的HCC治療策略尤其關(guān)鍵[2]。Casein kinase 2 alpha 2（CSNK2A2,CK2α'）酪蛋白激酶CK2α'是蛋白激酶CK2的催化亞單位，蛋白激酶CK2是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶之一，也是一種以磷酸化絲氨酸/蘇氨酸位點為主的蛋白激酶，CK2可以磷酸化數(shù)百種生理底物，參與了大量人類蛋白質(zhì)的磷酸化修飾[3]。人體中，包含兩個CK2激酶基因CSNK2A1和CSNK2A2，分別編碼高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白CK2α和CK2α'[4]。CK2激酶可以作為單體激酶發(fā)揮作用，也可以在兩個CK2激酶蛋白（CK2α和（或）CK2α'）和兩個調(diào)節(jié)蛋白CK2β（CK2β由CSNK2B編碼）組成的四聚體復(fù)合物中發(fā)揮作用[5]。蛋白激酶CK2被報道參與重要的細(xì)胞生物學(xué)過程如細(xì)胞生長和增殖[6]、細(xì)胞存活、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和血管生成[7]。在癌癥中，CK2可通過對原癌基因或是抑癌基因的磷酸化作用觸發(fā)不同的下游機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。研究顯示CK2蛋白的上調(diào)及核定位與胃癌、頭頸癌的臨床病理指標(biāo)和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[4]，而作為催化亞基存在的CK2α'在肝癌中的作用卻未見報道。本研究利用免疫組織化學(xué)及統(tǒng)計學(xué)分析方法探究該基因在肝癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，以此判斷CK2α'是否可能成為肝癌預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2003年4月—2009年9月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本83例。年齡范圍10～79歲，其中男67例、女16例。

入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷確認(rèn)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；（2）腫瘤可切除且無明顯肝外轉(zhuǎn)移；（3）未經(jīng)過其他治療或者至少4周前經(jīng)過治療未明顯控制腫瘤進(jìn)展；（4）年齡10～80歲，Child-Pugh評分A/B?；颊呷虢M后，記錄肝癌的直徑、是否存在門脈癌栓等臨床數(shù)據(jù)，并對患者進(jìn)行隨訪，記錄患者肝癌復(fù)發(fā)及死亡的時間。末次隨訪時間為2012年3月。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測

腫瘤組織標(biāo)本固定于中性緩沖的40%甲醛溶液中，將固定好的組織包埋于石蠟內(nèi)。組織切片4 μm厚，60℃烘烤2 h，冷卻后將切片脫蠟至水，在二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再次浸泡10 min，三次浸泡共30 min，之后在不同濃度梯度乙醇中復(fù)水處理。滴加3%過氧化氫甲醇液，常溫20 min孵育進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶滅活。雙蒸水洗5 min×3次，10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）通過沸水煮浴15 min進(jìn)行抗原修復(fù),常溫冷卻后雙蒸水洗5 min×2次，37℃下用1%BSA進(jìn)行封閉，30 min后吸棄封閉液，4℃下用CSNK2A2一抗（稀釋，1:100）進(jìn)行過夜孵育，并將切片置于濕盒中，以防干片。第二日將切片從4℃中取出，復(fù)溫15 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×4次，滴加兔二抗，37℃孵育30 min，棄兔二抗后使用DAB顯色，染色約3～10 min，出現(xiàn)磚紅色后置于雙蒸水內(nèi)終止染色，使用蘇木精對比染色10 min，1%鹽酸乙醇分化后使用自來水沖洗20～30 min，反藍(lán)，取出片子瀝干水進(jìn)行脫水處理，最后滴加中性樹脂50 μl，蓋玻片封片。免疫組織化學(xué)染色的對照設(shè)置：利用已知在肝癌組織中呈陽性表達(dá)的抗體進(jìn)行肝癌組織切片免疫組織化學(xué)染色，并將其作為陽性對照；并將相同的組織切片使用血清BSA染色作為陰性對照。免疫組織化學(xué)評分方法：Image Scope Count程序?qū)γ總€芯片點進(jìn)行“陽性Pixel”計算，每個組織芯片點的組化評分計算方法為Log10[255/平均強(qiáng)度]，其中平均強(qiáng)度=（弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性象素總強(qiáng)度）/（弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性象素數(shù)量）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果以頻數(shù)/百分比表示，采用χ2檢驗。卡方檢驗時，若樣本總量n≥40且0單元格的理論數(shù)T＜5，采用卡方檢驗，但其中一個格子理論數(shù)1≤T＜5時，采用連續(xù)性校正卡方檢驗；若有理論數(shù)T＜1，則用Fisher精確檢驗。Kaplan-Μeier生存曲線分析CK2α'的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK2α'在肝癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

通過免疫組織化學(xué)染色法檢測并分析83對臨床肝癌樣本中腫瘤組織及其癌旁正常組織中CK2α'的表達(dá)和定位情況。結(jié)果顯示，CK2α'在癌組織中的表達(dá)低于其對應(yīng)的癌旁正常組織，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1A。為進(jìn)一步量化CK2α'的表達(dá)水平，Image Scope Count程序?qū)γ總€芯片點進(jìn)行“陽性Pixel”計算，通過對每個芯片點陽性比例（Positivity=Npositive/Ntotal）的統(tǒng)計，結(jié)果顯示，CK2α'在肝癌組織及癌旁正常組織中的平均陽性表達(dá)率分別為47.8%及65.4%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。計算癌組織與其對應(yīng)癌旁正常組織的染色信號比值，結(jié)果顯示，74.7%的患者中CK2α'在癌組織（T）的表達(dá)量低于癌旁組織（N）。因此，認(rèn)為與癌旁正常組織相比，CK2α'在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，見圖1C。

2.2 CK2α'的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步研究CK2α'的表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系，對83例肝癌患者的腫瘤組織樣本染色的強(qiáng)度值，算出ROC曲線，根據(jù)ROC曲線中的敏感度和特異性差值計算出約登指數(shù)，設(shè)定絕對值最大的約登指數(shù)為分界點，將患者分為CK2α'高表達(dá)組和CK2α'低表達(dá)組，之后將高表達(dá)組賦值為“1”，低表達(dá)組賦值為“0”，結(jié)合隨訪資料中患者生存狀態(tài)及總體生存期進(jìn)行統(tǒng)計，Kaplan-Μeier生存曲線分析CK2α'與肝癌預(yù)后的關(guān)系。復(fù)發(fā)曲線采用同樣的分析方法。結(jié)果顯示，CK2α'低表達(dá)組的患者總體生存時間更短（圖2A），且更容易復(fù)發(fā)（圖2B）。

2.3 CK2α'與患者臨床病理特征的關(guān)系

CK2α'的表達(dá)在年齡、性別、門脈癌栓、AFP水平、CK18、腫瘤大小、包膜完整度、子灶、肝炎、肝硬化、病理分級及免疫組織化學(xué)指標(biāo)Hep-1間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），在CK19的陽性表達(dá)差異上有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CK2α'高表達(dá)的患者CK19陽性率更低，見表1。

表1 CK2α'的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (n(%))Table 1 Correlation between CK2α' expression and clinicopathological characteristics of HCC patients (n(%))

3 討論

蛋白激酶CK2（以前稱為酪蛋白激酶Ⅱ）是一種進(jìn)化上高度保守且普遍存在的蛋白激酶。通常以四聚體形式存在于細(xì)胞中，由兩個催化亞基（α或其亞型α'）和兩個調(diào)節(jié)亞基（β）組成，主要功能是控制底物選擇性和酶穩(wěn)定性[8]。它在真核生物的所有組織中均有表達(dá)，對正常胚胎發(fā)育至關(guān)重要。CK2磷酸化數(shù)百種底物，幾乎參與所有細(xì)胞過程，但其主要功能與細(xì)胞生長、增殖和存活有關(guān)[9]。另外，Dominguez等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶CK2參與調(diào)節(jié)腫瘤中關(guān)鍵的信號通路，如Wnt、JAK/STAT和PTEN/PI3K/Akt-PKB等，并且可以通過增強(qiáng)ΜYC原癌基因的穩(wěn)定性[12]、激活NF-κB（抗凋亡因子）、抑制DNA修復(fù)和抑制腫瘤抑制磷酸酶PTEN[13-14]來促進(jìn)腫瘤發(fā)生。盡管在多種實體瘤及血液腫瘤中都檢測到了CK2的表達(dá)上調(diào)，但并非所有數(shù)據(jù)都支持CK2的過表達(dá)可以驅(qū)動腫瘤發(fā)生。Storz等[15]研究結(jié)果顯示，CK2α'在濾泡性淋巴瘤中轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)，但其下調(diào)機(jī)制尚未明確，并且CK2α'在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中也表達(dá)下調(diào)[4]。說明蛋白激酶CK2在腫瘤中的作用很大程度上取決于它如何調(diào)節(jié)關(guān)鍵的信號通路，這在不同的癌癥中可能是不同的[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)CK2α'在肝癌組織中的表達(dá)相較于癌旁組織顯著下調(diào)。對患者的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，CK2α'高表達(dá)的患者更不易復(fù)發(fā)，且總生存時間更長。CK19作為肝祖細(xì)胞和膽管細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞角蛋白[17]，通常能在惡性腫瘤及癌癥早期復(fù)發(fā)的患者血液中檢測到，常與肝癌預(yù)后不良相關(guān)[18]。進(jìn)一步對83例肝癌患者的臨床病理指標(biāo)分析后發(fā)現(xiàn)，CK2α'的表達(dá)在肝癌患者的年齡、性別、肝硬化、肝炎、腫瘤大小、CK18、病理分級等臨床指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但在CK19的陽性表達(dá)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CK2α'低表達(dá)患者CK19的陽性比例更高，說明CK2α'低表達(dá)的患者預(yù)后更差。

HCC作為世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的主要死亡原因之一，發(fā)病率和致死性高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，人們不斷尋求發(fā)現(xiàn)篩查、診斷和治療策略，以改善這種惡性腫瘤的預(yù)后。用于監(jiān)測和早期HCC診斷的有用生物標(biāo)志物顯得至關(guān)重要[19]。本研究探討了CK2α'與肝癌形成及預(yù)后的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)CK2α'在肝癌患者的腫瘤組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，結(jié)合隨訪資料分析，發(fā)現(xiàn)CK2α'低表達(dá)的患者生存期短、復(fù)發(fā)率高，且CK2α'低表達(dá)的患者病理指標(biāo)CK19陽性比例高，以上結(jié)果均提示CK2α'的表達(dá)水平與肝癌預(yù)后有關(guān)，CK2α'有望成為肝癌患者的診療新標(biāo)志物。