韓吳琦，方慧祥，呂晉*，黃永麗

1 河南省開封市食品藥品檢驗所，開封 475000；2 云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，曲靖 655000；3 河南大學淮河臨床學院，開封 475000

通氣丸是由青皮（醋炙）、陳皮、蒲公英、連翹、木香、甘草和乳香（麩炒）共7 味中藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、行氣化瘀的功效［1］，用于產后氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯雜的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛、惡露不絕、血暈昏迷、大便秘結、無乳等癥。方中青皮疏肝破氣，消積化滯；陳皮理氣健脾，燥濕化痰；連翹清熱解毒，消腫散結，疏散風熱［2］。該處方現(xiàn)行質量標準制定時間早，且僅有鑒別項而無其他測定指標，不能客觀全面反映通氣丸的質量。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了通氣丸中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量，以期為通氣丸的質量控制和標準修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 島津液相色譜儀（SIL-20A 自動進樣器、LC-20AT 泵、SPD-M20A230V 光電二極管陣列紫外可見光檢測器、CTO-20A 柱溫箱、DGU-20A5R 脫氣機、LCsolution 色譜工作站，日本島津制作所）；MS205DU 型電子天平（梅特勒—托利多公司）。

1.2 試藥

連翹酯苷A（批號：111810-201707，含量97.2%）、蕓香柚皮苷（批號：BW5225-2017030）、橙皮苷（批號：110721-201818，含量96.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；通氣丸（河南泰豐生物科技有限公司，規(guī)格：每袋裝9g，批號：20190301、201903031、20200301、20200302、20200303）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（分析純，西亞化工試劑有限公司）；水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，比例為35∶65；檢測波長為283nm；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；進樣量為10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取通氣丸適量，研細，取約0.4g，精密稱定后，轉移到帶塞的錐形瓶中。精密加入50ml 甲醇，稱定重量，超聲處理40min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品適量，加甲醇制成含連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷分別為71.79、41.28、308.85μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備

按通氣丸的處方和制法分別制成缺連翹的陰性樣品和缺青皮、陳皮的陰性樣品，再按照“2.2.1”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下的供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果表明，以混合對照溶液的色譜圖為參考，陰性對照品的色譜圖在對應位置無相應色譜峰，供試品溶液的色譜圖在對應位置有相應色譜峰，且相鄰色譜峰均能達到有效分離，其他成份對待測成份均無干擾。

圖1 混合對照品（A）、供試品（B）、缺連翹陰性樣品（C）和缺青皮、陳皮陰性樣品（D）的HPLC 圖

2.4 線性關系

取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過。分別精密吸取2、4、6、8、10、20μl 濾液，按“2.1”項下色譜條件測定。以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。3 種成份在各自范圍內線性關系良好，詳見表1。

表1 3 種成份線性關系

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10μl，按照“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，測得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、1.74%、1.50%。表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下的供試品溶液，分別在2、4、8、16、24、48h 進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定峰面積。測得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為0.28%、0.32%、0.15%。表明樣品溶液在48h 內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一樣品（批號：201903031）6 份，按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件測定峰面積。測得樣品中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的平均含量分別為2.8537、2.4894、7.1189mg/g，RSD 分別為0.65%、0.48%和0.52%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：201903031）6 份，每份約0.2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。分別精密加入連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品0.4307、0.2477、1.8531mg，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定并計算回收率，其結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

取5 批樣品，按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，以峰面積計算含量，結果見表3。

表3 通氣丸中3 種成份的含量測定結果 mg/g

3 討論

3.1 測定指標的選擇

通氣丸中，青皮、陳皮為君藥，蒲公英為臣藥，連翹、木香、乳香為佐藥，甘草為使藥。君藥主要用于治療產后因氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯雜造成的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛等；佐藥連翹主要佐助君藥發(fā)揮治療作用和治療次要兼證［3］。青皮（醋炙）味苦、辛，溫，入肝經，可疏肝破氣；陳皮味苦、辛，溫，歸肺、脾經，可理氣調中。二者主要活性成份分別為橙皮苷和蕓香柚皮苷［4］；佐藥連翹中的主要活性成份為連翹酯苷A。橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調節(jié)免疫力、防輻射、保護心血管系統(tǒng)等［5］藥理活性；蕓香柚皮苷和橙皮苷配伍給藥可明顯促進正常小鼠的小腸推進［6］；連翹酯苷A 可抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性，從而減少乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的水解而使其堆積，發(fā)揮擬膽堿作用［7-8］。ACh 為膽堿能興奮性神經遞質，能使胃腸平滑肌收縮張力和振幅升高［9］。三者均可促進胃腸推進收縮和產后排氣，因此本研究選取橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 作為通氣丸的質量控制指標。

3.2 檢測波長的選擇

在200~400nm 范圍內對混合對照品溶液進行紫外掃描。結果表明，橙皮苷、蕓香柚皮苷、連翹酯苷A 分別在283.6、282.4、291.0nm 波長處有最大吸收，參照2020 年版《中國藥典》［2］及相關文獻［10-12］，本研究選擇283nm 作為檢測波長。

3.3 提取方法的選擇

基于橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 的理化性質，本實驗分別以50%、75%、100%甲醇為溶劑進行提取，考察不同時間（30、45、60min）和不同方式（超聲、回流）處理樣品后對3 種成份含量的影響［10-12］。結果表明，以純甲醇為提取溶劑時，超聲45min 后提取效果最佳，且耗時短、操作簡單、便捷。

3.4 流動相的選擇

本實驗考察了不同比例的甲醇-乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動相系統(tǒng)［13］，并采取等度洗脫、梯度洗脫進行試驗。結果表明，以甲醇-0.1%磷酸溶液（35∶65）為流動相的色譜圖基線平穩(wěn)，各組份峰形和分離效果均良好，因此確定其為流動相。

3.5 含量測定結果分析

不同批次通氣丸中3 種成份的含量存在一定差異，這可能與處方中各組份的產地、采收季節(jié)、炮制方法、提取方法以及制劑的生產過程等多種因素有關。為了達到中藥復方制劑質量的一致性，建議藥品生產企業(yè)除了控制制劑的生產過程外，還要加強把控藥材的來源、種植方式、采收、加工與炮制等環(huán)節(jié)，保證入藥品種的質量。

通氣丸的現(xiàn)行質量標準尚未規(guī)定處方中各組份含量，難以體現(xiàn)樣品中有效成份的整體變化情況，也難以保證中藥藥效物質基礎的有效傳遞。多指標成份含量測定的控制模式可實現(xiàn)對多個成份的同時把關和對產品質量的精確控制，能有效反映中藥制劑的有效性和穩(wěn)定性。基于此，本研究建立的方法可同時測定通氣丸中3 種活性成份的含量，對通氣丸生產工藝的規(guī)范、優(yōu)化和質量控制有一定指導作用，可作為其質量評價的有效方法。

綜上，本實驗所建立的檢測方法簡便、快速、靈敏度高，可對通氣丸中橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 進行定量測定，為完善通氣丸的質量標準提供了一定的參考。