楊雪麗，程玉婷，湯 承，岳 華

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

目前，已證實(shí)能引起羊呼吸道疾病的常見病毒包括山羊副流感病毒3 型（CPIV3）、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）等；常見的細(xì)菌包括多殺性巴氏桿菌（Pm）、溶血性曼氏桿菌（Mh）；常見的支原體包括綿羊肺炎支原體（Mo）、絲狀支原體簇成員（Mm Cluster）［1-4］。本研究對一起藏綿羊的呼吸道疾病進(jìn)行病原確診，以便針對性防治。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況和臨床癥狀 2021 年11 月，四川省甘孜州某藏綿羊養(yǎng)殖場一周內(nèi)連續(xù)有21 只藏綿羊發(fā)病，其中死亡8 只，發(fā)病率為31%，致死率為38%?；疾〔鼐d羊主要表現(xiàn)為精神不振、發(fā)熱、咳嗽、流膿鼻涕、呼吸困難等呼吸道癥狀，部分出現(xiàn)腹瀉癥狀。

1.2 樣本處理 將養(yǎng)殖場送檢的5 份患病藏綿羊深部鼻腔棉拭子浸入滅菌的5 mL PBS液中，渦旋混勻，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和材料 RNAiso Plus 試劑、Prime ScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、革蘭氏染色液、血瓊脂平皿，TSA瓊脂培養(yǎng)基和TSB肉湯培養(yǎng)基。

1.4 核酸提取 從臨床樣本中分別提取DNA 和RNA。使用RNAiso Plus 提取棉拭子總RNA，并按照Prime ScriptTMRT 試劑盒說明書合成cDNA，用酚-氯仿法提取棉拭子總DNA。cDNA和DNA均于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病原的PCR檢測 采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法對CPIV3、BVDV、BCoV、Pm、Mh、Mo、Mm Cluster 進(jìn)行PCR 檢測，引物信息見表1。表1 引物送上海生工生物有限公司合成。

表1 引物信息

1.6 Pm 和Mh 的分離鑒定 對Pm 和Mh 的陽性樣本進(jìn)一步作細(xì)菌分離鑒定。將5 份Pm、Mh 陽性鼻拭子樣本分別接種于含有10%小牛血清的TSB肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床過夜培養(yǎng)16～24 h，增菌后接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16～24 h。觀察菌落的生長狀況，挑取疑似單個菌落在血瓊脂平板上純化3次，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)，并對純化后的細(xì)菌進(jìn)行特異性PCR鑒定。

1.7 Mh 和Pm 的血清型鑒定 采用文獻(xiàn)報(bào)道的PCR方法對分離菌進(jìn)行血清型鑒定，引物信息和來源見表2。引物均送上海生工生物有限公司合成。

表2 分型引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測結(jié)果 從5 份鼻拭子中均檢出了Mh 和Pm，未檢出其他病原。PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)Blast 比對，證實(shí)為Mh 和Pm 的目的片段（電泳圖見圖1和圖2）。

圖1 藏綿羊鼻拭子Mh的PCR檢測結(jié)果

圖2 藏綿羊鼻拭子Pm的PCR檢測結(jié)果

2.2 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 從5 份鼻拭子中分離得到5 株P(guān)m 和Mh。Pm 在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，長出淡灰白色、露珠狀半透明菌落，菌落表面光滑、濕潤，無溶血環(huán)。鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌，菌體兩端鈍圓，呈細(xì)小的短桿狀或球桿狀。經(jīng)特異性PCR鑒定，確定分離菌為Pm。

Mh 在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h 長出露珠樣大小、圓形、光滑的灰白色菌落，并伴有草綠色的溶血環(huán)。革蘭氏染色后鏡檢可觀察到單個或散在排列的革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓。經(jīng)特異性PCR鑒定，確定分離菌為Mh。

2.3 Pm、Mh血清型鑒定結(jié)果 血清型鑒定結(jié)果顯示，只有A2型引物從獲得的5株Mh 中擴(kuò)增出目的片段（圖4），確定獲得的5 株Mh 均為A2 型Mh；Pm 的A、B、D、E、F 血清型引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有D 型引物從5 株P(guān)m DNA 中擴(kuò)增出目的條帶（圖5），確定分離到5株D型Pm。

圖4 Mh的血清型鑒定結(jié)果

圖5 Pm的血清型鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 羊感染Mh 情況 Mh 是反芻動物重要的呼吸道致病菌之一，可引起新生羔羊發(fā)生急性肺炎，Mh 根據(jù)莢膜抗原進(jìn)行血清分型，共有12 個莢膜血清型（1、2、5～9、12～14、16 和17 型），從羊中最常檢出1 型、2 型、6 型Mh［10］，國內(nèi)羊群中最普遍的Mh 莢膜血清型是A2 型。目前尚無預(yù)防溶血性曼氏桿菌的相關(guān)疫苗，使用抗生素是治療本病的主要手段，近年來Mh 耐藥性的逐漸上升給Mh的治療增加了難度。

3.2 羊感染Pm 情況 Pm 根據(jù)其莢膜抗原可分為A型、B型、D型、E型和F型5個血清型［11］，我國羊群中以莢膜A型、B型、D型為主。近年來D 型多殺性巴氏桿菌在國內(nèi)羊群中流行較多。不同Pm 莢膜血清型之間交叉免疫保護(hù)性低，目前還沒有針對D 型莢膜血清型Pm 的疫苗，有必要研制A、B、D型三價(jià)疫苗，為羊多殺性巴氏桿菌病的有效防控提供方便。

3.3 藏綿羊感染Mh、Pm 情況 不同羊群感染Pm 和Mh 的現(xiàn)象很普遍，但關(guān)于藏綿羊感染Mh、Pm的報(bào)道還很少。江金歡等［12］2017年從西藏山南市某地死亡的綿羊病料中分離出A2型溶血性曼氏桿菌；元振杰等［13］2018年從西藏日喀則市某發(fā)病羊場也分離到溶血性曼氏桿菌，且該分離株有很強(qiáng)的致病性；關(guān)于藏綿羊D型巴氏桿菌的報(bào)道僅有一篇［14］。

4 結(jié)論

結(jié)合臨床癥狀和細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果，確定該養(yǎng)殖場藏綿羊發(fā)生的呼吸道疾病是由多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌混合感染引起的。進(jìn)一步分型結(jié)果顯示，Mh 為A2 型，Pm 為D型?！?/p>